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シークエンサーについて教えてください

1 :ジンジン:01/09/24 01:47
最近ゲノム解析ということでシークエンスをし始めたのですが、
どうもうまくいきません。使っているのはABI377で、PCR産物をダイレクトに
読んでます。普通なら、500〜600bpは確実に読めるはずなのですが、
200〜300bpあたりで突然シグナルが急降下してしまい、長く読めません。
テンプレート過剰でシグナルの急降下は起きるらしいのですが、
過剰という量は入れてないのでお手上げです。
何かアドバイスやコツがあればよろしくお願いします。

2 :名無しゲノムのクローンさん:01/09/24 02:00
PCR産物をダイレクトに読めるの?
いいなー。

3 :名無しゲノムのクローンさん:01/09/24 13:18
テンプレート量を振ってみた?
PCR産物をテンプレにする場合、増幅効率がいいので
テンプレがプラスミドの場合と同じモル数にすると過剰量になることがあるよ。

4 :名無しゲノムのクローンさん:01/09/24 19:27
ABI377なら、EtOH沈すれば
600bpは余裕で読めるはず。

5 :ジンジン:01/09/24 23:57
ありがとうございます。
とりあえずテンプレート量を一度振って、挑戦してみます。
あと、Et-OH沈時は自分は3MNaAcと100%で氷上に10分くらい置いて
遠心して70%で洗うという方法なのですが、もっとベターな方法ありますか?
あと377の扱いについて何かポイントとかはないでしょうか
サンプルに異常がないとすれば機械を疑いたくもなってしまうので…
皆さんよろしくお願いします。

6 :名無しゲノムのクローンさん:01/09/25 00:22
沖縄名産の柑橘類です。

7 :名無しゲノムのクローンさん:01/09/25 00:32
それはシークワーサー

8 :名無しゲノムのクローンさん:01/09/25 13:33
PCR反応に使ったプライマーよりさらに内側のシーケンシング
プライマーをいくつかデザインして読む。
あれこれサンプル精製の条件を変えても、経験的にだめなときは
だめです(特にゲノムのPCRの場合)銭はかかるが時給1000円
と考えると元はとれるはず。

9 :名無しゲノムのクローンさん:01/09/26 12:18
私は、PCR産物の場合PEGを使っています。
フィルター系精製キットより集率は落ちますが、ピークはきれいな気がします。PEG等量、氷上1時間、70%Et-OH washです。

10 :名無しゲノムのクローンさん:01/10/01 03:27
>8
同意。
ゲノムは特に読めないとこ読めませんよね。
PCR産物とのことですが、どっち側からよんでも駄目ですか?
あるいはめんどくさいけど昔ながらにクローニングして、
Dye Primer法で読むのがきれいに読めると思います。
ABIだったらなんのキットを使っていますか?
新しく出たBigDyeの新バージョン、
使っている方いたら情報きぼん。

11 :名無しゲノムのクローンさん:01/10/16 08:36
シークエンスのことで教えて下さい。
     新しいプライマーをデザインしてシークエンスしました。
     paperにだす(PCRproductが目的のmRNAと合致したことを示す)
     ときは、rightとleftの両方から結果が必要なんでしょうか?
     完全に読み込むには両方が必要なように思いますが、いかがでしょうか?

     よろしくおねがいします。

12 :名無しゲノムのクローンさん:01/10/16 18:25
3700か3100を買うこととお薦めする。
ひじょーに簡単。感度良すぎるけど

13 :名無しゲノムのクローンさん:01/10/16 18:27
>>8
びぐだい、にゅーばーじょん、けっこうよい。
かんどよし。

14 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/03 05:46
?? >>13

15 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/03 06:48
big dye ver 3がよいということとおもわれ。

16 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/03 19:02
>12
3700はもうすぐ製造中止になるそうだぞ。
メーカー裏情報!

17 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/20 07:17
ABI377なら、EtOH沈すれば
600bpは余裕で読めるはず。

18 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 18:35
377のゲルカセット誰か余してない?

19 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 20:37
ちょっと皆に教えてもらいたいことがあります。現在、PCR産物のシークエンスをやっています。PCRは
degenerated PCRです。増幅されたPCR断片をGELから精製し、TA-cloningでプラスミドにインサートした。
正確に塩基を読むため、rightとleft両方から読みました。しかし、
いつも、シークエンスは片方のプライマーしか確認されず、これを生じた可能性は何を考えられますか。
誰か、教えて下さい。お願いします。 ちなみに、ゲルからPCR産物の精製はキアゲンの精製キット使用、
TA-CLONINGはプロメガのpGEM-T easy vector systems キット使用しています。

20 :毒舌:01/11/21 20:51
>>11
当然両側から読めよ。
そんなことこんなところで聞いてるおまえの書く論文は、たいしたレベルじゃないだろうから、
おまえが投稿するジャーナルでは、片側だけでいいのかもしれんがね。

21 :毒舌:01/11/21 20:55
>>19
degenerated PCRやったんなら、当然、プラスミドのぷらいまー使って
シーケンス反応してるんだろ?
オレの後輩が、昔、いつもはBluescript使ってるんだけど、
たまたま違うベクター使って、片側しか読めないとかほざいてたことあったけど、
よく話を聞いて見たら、そのベクターにM13Revプライマーの配列なかったことあったぞ。
そういうミスじゃなければ、シーケンス反応のキット買い直せ。

22 :毒舌:01/11/21 20:57
PCRproductを最も綺麗に、そして簡単に読む方法は、
PCRのプライマーの外側にシーケンス用のプライマー配列をくっつけといて、
ダイプライマー法で読む方法だね。

23 :毒舌:01/11/21 21:04
実験が上手く行かないと、すぐキットや機械のせいにするやつは
DQN

24 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/11 13:46
3700は本当に製造中止??

25 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/20 17:11
皆さんのところのシーケンサーは誰が管理していますか?
うちのは下っ端の助手が管理しているけど、専任の
技官くらい雇って欲しいぞ。


26 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/20 17:21
え?学生じゃないの

27 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/20 18:34
Direct Sequenceする時ってテンプレートのPCR産物の精製どうしてますか?
今実験室の隅にTAKARAのSUPREC-02というスピンカラムが落ちてたのですが
使ってる方いますか。テンプレートの長さは2kbです。
上にカラムよりPEG沈の方がきれいに読めるとありますがやっぱりロスが気になります。


28 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/20 19:29
>>27
隅に落ちてる→使われてない→使えない

PEG+QIAGENでどう?

29 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/21 13:59
>27 Amersham PharmaciaのEXO/SAP・IT処理で問題なし。
コストはカラム使うより安く、しかも早い。お薦めじゃよ

30 :27:02/01/21 20:10
いいキット教えてくれてありがとう。早速使ってみます>29

>28 まさにその通りですね。いままで隅に落ちてるキット使っていい目にあった
ことないです。

31 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/14 00:37
>>25
うちは共同利用施設にあるんで、
そこの技官が管理しています(薬大卒)
今、Big dye Ver.3に移行中なんだけど、
こないだようやくマトリックスとれたそうですが、
どーもサンプルが100bくらいしか出ないらしいんですよね。
まだサンプル作ってくる側(研究室スタッフ)も
慣れてないのかも知れないですけど。

いまさら後には戻れない(っつーか試薬供給がない)ので、
早く良いサンプル取れねーかって、悩んでいるそうです。

私はFACS担当なので、のーんびり(でもLSRつかえねぇぜ)

32 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/15 21:59
Ver.3 Dye Terminatorは以前のVer.にくらべて長く読めると聞いていましたが、
個人的な感想としては、Freeの色素がEtOH沈(推奨プロトコール通り)で落ちにくく、5'側には50bpくらい伸びるけど、3'側にはそうでもない(ってーかむしろ以前より短い)って印象があり、
全体的に読める距離は、以前は800bpくらいいってたのが、Ver.3では500〜650bpって感じですね。
ですから、プライマーの設計位置は、以前よりも5'側にした方がいいんじゃないかと思うのですが、どうでしょう?>>31
それとも私の腕の問題で、Ver.3でもうまくやれば800bpくらいいけるんでしょうか?
ちなみにスピンカラムは使用経験がございません。

33 :31:02/02/16 21:05
>>32さん
をを、詳しいレスありがとです。
今のところ310(カラム)から移行中なのですが、
今まで500baseくらい読めるようなsampleを
作ることの出来る人が、Ver.3で100baseくらいしか
読めてないので、ちょっとプライマーについてお話を
してみます。あと、シーケンサー担当の技師さんにも。
カラムでうまくいけば、3100(ゲル)もそちらに
移行すると思いますので。

FACS担当技師でした(今日はお休み)。

34 :31:02/02/16 21:08
gelタイプのは3100じゃなかった。
逝ってきます・・

35 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/16 23:55
BigDyeV3を試してみたけど蛍光強度が増したのでさらに薄めて使えるようになった。
過剰なDyeは薄めるとそれほど気にならなくなると思う。薄め液は自作の
25 mM TrisCl (pH9.0), 2.5 mM MgCl2
を任意の割合でBigDyeと混合して使う。今のところ1/20くらいまでうまくいって
いる。エタ沈は室温に戻した反応液に塩とエタノールを加えて混合後、即座に室温
遠心、室温リンス(必要なら2回)でほぼ先頭から読めるけど。


36 :31:02/02/19 11:16
プライマーの位置をちょっと変えてみたら、うまくいったそうです
<Ver.3
やはり3'側があまり読めなかったらしい(それ以前に長さもなかったが)
しかーし、他の人たちはうまくサンプル作れるよーになるんだろうか。
できない人はいつまでたってもできないよーな・・・。

しかし、1/20まで薄められますか??>>35
1/5くらいまでは薄めてる人いるようですけど。

37 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/18 23:58
あげ

38 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 23:25
hage

39 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/20 23:21
漏れはアマシャムファルマシアのThermosequenaseのキットが好き。
なんつっても反応が速いし、GCに強い。

40 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/02 04:33
800mmのキャピラリーってどうなの?

41 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/09 19:47
シークエンスの外注って、どんなもんなんですかね?
料金表に600baseまで○円と書いてあるけど、
600base保証してくれるということなのだろうか?
外注してNNNNNNNNNとかなってたら笑えるなぁ。

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