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一個の大腸菌に一個のplasmidしか入らないの?

1 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 06:17
transformationのときにいつも疑問に思うんですけど、
ほんとにそうなんでしょうか?

だとしたら、なぜなんでしょうか?

2 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 07:12
生物学の簡単な質問は「質問スレッド」へ。
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/997795662/l50

3 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 08:34
それは分配の確率で、次第に1つに偏って行くのです。大腸菌の分子生物学全盛期には常識だったんだけどね。

4 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 09:15
厳密に言うと違います。
ポイントミューテーションで一塩基しか違いのないプラスミドなら2個入ります。
大腸菌はそこまで区別できませんから。

5 :1:01/11/21 09:36
最初、複数種のplasmidが入りうるけれでも、その後そのうちの一つが
選択されて他のは排除されるということですか?

6 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 10:31
誰から習ったのか知らないが、トランスフォーメーション用のコンピテントセル
には、複数のプラスミドが入りうる。だから、DNA の濃度を高くしてトランス
フォーメーションをしたら、必ず2つ以上入る。このとき、ヘテロな分子種なら、
コロニーがキメラ状態になる。だから、ligation mix でトランスフォーメー
ションしたら、必ずコロニーの purification が必要だ(とくに transformant
が多い時)。
 2つ以上の plasmid が入った時でも、それぞれの ori が異なれば(pBR322
と pACYC184 とか)、両方の plasmid が比較的安定に保持される。
 もし、 ori が同じ場合でも、それぞれの plasmid に異なった抗生物質耐性の
遺伝子が入っていて、両方の抗生物質をかかさず培地に入れていれば、二つとも
保持されるよ。強引だけどね。
 それから、この程度の質問で、スレッドを立てるな!

7 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 11:06
例えば、同じplasmidでinsertが入ったものとemptyのものが
同じ大腸菌に入ったらどうなるの?両方増えるの?

8 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 11:16
>>7
こちらを参照
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/1006291034/2

9 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 11:18
>8
Himajin

10 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 12:06
>>7
いっぺん、空のBlueScriptとinsert入れたのと一緒にtransformationかけてまいてみ。
一面真っ青になるから。
>>8に賛成。クソスレはとっとと終了してくれ。

11 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 12:28
>10
7の質問に対する答えとしては零点。

12 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 12:49
>>11
代わりの答えを用意できない時点で、落第。(藁

13 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 13:53
haihai w

14 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 15:30
バカスレにはバカが集まるな。(藁

15 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 15:37
>14
自分のこと言ってることに気づいてるか?

16 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 15:39
>14
人をバカ呼ばわりする前に7の質問に対する完璧な答えを言いたまえ。

17 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 15:44
>>11
まあ、乱暴な実験ではあるが、とりあえずの説明としてはこんなもんじゃないか?>10
・同時にTFかけても、一つの細胞に2種のプラスミドが入ったと確定できない
・TF後の2種のプラスミドの複製→分配に関する説明がない
・「なぜ」emptyプラスミドの方が増える(と考える)のか、説明がない
という点では、中途半端だがな。
しかし、元々7がこの程度のことも自分で考えられないのが悪いのだ。
あ、もしかして7=11?(w

18 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 15:48
うううう、見える、見えるぞよ。
9=11=13=15=16が、モニターの前で真っ赤になってキーボードを叩いている姿が見えるぅぅ。

19 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 16:00
>18
自分の文章をもう一度冷静に読んで、そのバカさ加減に気づけ。

20 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 16:22
>>19
あ、もしかして、某スレの”帰ってきた1”?
いらっしゃ〜い。

21 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 16:46
うんこあげ

22 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/21 17:05
>20
パトロール隊長じゃないっすか?

23 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/22 07:07
>>7
>>11
>>16
>>6 をよ〜く見てみろ。答えが書いてあるだろ?良く考えてみな。

24 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/22 10:43
分配の意味するところがよくわかりません。

25 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/23 05:27
>>24
分配の説明:
例え2種のプラスミドが同一の細胞に入っていたとしても
細胞が分裂するときにそれらのプラスミドはおさらばする

DNAが複製される

また分配がおこる

これを繰り返すと最後にできたコロニーは
単一のDNAだけが残るということ。
みんなレスしてばかよばわりするくらいだったら
これくらい説明しようね。

26 :2=6=8=23:01/11/23 07:34
>>25
>みんなレスしてばかよばわりするくらいだったらこれくらい説明しようね。

 ルール破りのスレにずいぶん親切にレスしたつもりなんだけど、
24 を見てシカトしたのは変か?

27 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/23 07:52
基本的な質問ですみません。

transformationのときに、一個の大腸菌にplasmidは何個くらい入る可能性があるのでしょうか?

なお、2=6=8=23の方はこのスレ自体無視してくださってかまいません。
今までありがとうございました。

28 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/23 08:30
2=6=8=23ではない通りすがりの者だが、こう言っちゃ悪いけど、
分配に関する25の説明はひどいね。俺がテストの採点者だったら、
まあ100点満点で5点ぐらいかな。厳しいことを言うようだが、
25自身、自律複製DNAの分配という現象が理解できてないっぽい。
「そんなことはない、俺は完全に理解している」って言うんだったら、
次の質問に答えてみてよ。全部大腸菌の場合でいいからさ。

1)TFされたプラスミドがシングルコピープラスミドである場合と、
マルチコピーである場合の分配のメカニズムに関する違いを述べよ。

2)相異なる2種のプラスミドがひとつの細胞に入ったとして、
細胞分裂を繰り返しても常にその2種類が1細胞中に保持される場合、
どのような可能性が考えられるか? 少なくとも3つの例を挙げよ。

3)ひとつのプラスミドが一分子内で複数のoriを持つ場合、
そのプラスミドの分配に関してどのような現象が観察されるか?

こういったことがわかっている上で25の解説をしたのなら、説明を
はしょり過ぎ。上の質問に答えられないのなら、ただの知ったかと
言われても仕方が無い。

>>2=6=8=23
この問題は、「この程度でスレ立てんな」と罵倒して質問スレ送りに
するような単純な話ではない。独立したスレを立てるに値すると俺は思うよ。
だけど>>6はうまくまとまった良い説明だね。ただ、コロニーの
purificationとは言わんわな。それを言うならisolationだな。

29 :2=6=8=23:01/11/23 08:57
>>28
 分かった。これが優良スレになりそうなんだな。君の言う事に一字一句
同意するよ。俺は質問に答えない。

>purificationとは言わんわな。それを言うならisolationだな。
 そう言えばそのとおりだな。以前居たラボでは、purify というのが
業界用語だった。

30 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/23 09:09
>2=6=8=23
質問に答えないんならいちいちレスすんな、バカ。

31 :28:01/11/23 09:15
>>27
>>transformationのときに、一個の大腸菌にplasmidは何個くらい
>>入る可能性があるのでしょうか?

それは形質転換の方法で違う。ただし、言うまでもないが、一番
影響するのは大腸菌細胞とプラスミド分子の数の比だ。少数の
大腸菌に大過剰のプラスミドを混ぜれば、そりゃあ複数のプラスミドも
入るだろうし、逆に大量の大腸菌細胞にほんのわずかの分子数の
プラスミドを混ぜれば、一個の細胞に一個のプラスミドが入るのが
やっとだろう。それを分かった上で、以下の説明を嫁。

バクテリアを塩で処理してコンピテントにする場合(塩化カルシウム法、
ルビジウム法、ハナハン法等)、プラスミドに限らず核酸は比較的
まとまった状態で細胞壁に付着すると言われている。

一方、エレクトロポレーションの場合、プラスミドの取り込み
は単純にプラスミド分子の拡散状態に依存する。つまりバラける。

だから、複数のプラスミドを意図的にひとつの大腸菌細胞に取り込ませ
たいときには、塩でコンピテントにした細胞に濃いDNAを混ぜる。逆に
なるべく散らしてひとつの細胞にひとつのプラスミド分子だけが入る
状態にしたいときは、薄めたDNAと電気パルス穿孔法の組み合わせが効果的。

これで>>1に対する答えにもなっていると思うが、どうよ?

32 :28:01/11/23 09:29
>>分かった。これが優良スレになりそうなんだな。

どうもねえ。なんか五月蝿い粘着が一匹紛れ込んでるみたいなんで、
優良までもって行けるかどうか自信ないけどな。30が1と同一人物だったら、
激しく鬱だな。(ワラ

このスレが、わけがわからなくなった最大の戦犯は>>3のレスだろうな。
形質転換時のプラスミドの取り込みと、取り込まれた後の娘細胞への分配は、
全く別の問題だからな。>>28にあんな書き込みした俺が言っても説得力は
ないが。(ワラワラ

33 :23:01/11/23 09:30
>>31
 エレクトロポレーションの時は supercoil の DNA が入りやすい
傾向にあるから、注意が必要だな。だが、1 の知りたいのは、これか?

>>30 無意味な書き込みで age てる君と同じくらいの馬鹿だが、なにか?
おれは age なかったんだげどね。

34 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/23 09:38
久しぶり。森下がってますね。皆さん勝手なこと言ってますが、この問題は数学セミナー増刊入門現代の数学10、自然現象と確率過程83−96ページを見なさい。
ここでは複製効率は考慮されてませんが、プラスミドの不和合性に関する数学的考察が示されています。ちゃんちゃん。

35 :23:01/11/23 09:40
>このスレが、わけがわからなくなった最大の戦犯は>>3のレスだろうな。

>>4のレスも、良く分からんな。1はこの2つのレスはあまり気にしない方が
いいな。

36 :28:01/11/23 09:52
>>23
そうなんだよなあ。俺も最初>>6を読んだとき、取り込みと分配の両方を
押さえてあるし、簡潔にして明快で、あれ以上何も言うことないと思ったんだけどね。
なんでこんなに荒れるのか訳わからん。

>>34
おい、不和合性に関する数学的考察ってなんじゃい。すっげー興味あるぞ。
今すぐ全部丸写しして、ここにうぷキボーン。数学セミナー高いから買うのイヤ。
うぷしてくれたら「神だ!」って言ってやるぞ。

37 : :01/11/23 11:12
>>1
やってみりゃいいじゃん

38 :23:01/11/24 05:30
>>>34
>おい、不和合性に関する数学的考察ってなんじゃい。すっげー興味あるぞ。

 想像するに、

1)一つの大腸菌に2つの異なったプラスミド(ori は同じ)が入ったとする。
仮に、copy number を8とする。
2)まず、それら2つのプラスミドがそれぞれ4個づつ(合計8個)になった。
3)細胞分裂の最、その8つのプラスミドが4つづつ分配される。このときど
ちらの種類のプラスミドが選ばれるかは、ランダムに決まる。
4)それぞれの細胞に分配されたプラスミドが、倍になる(合計8個)このとき、
もとの比率は保存される。
5)3と4を繰り返す。
 この時、n 回細胞分裂した時に、片方のプラスミドだけを持つ大腸菌が現れる
確率を求めよ。

ってところか。あとは、copy number を a とした時に答えがどうなるかとか。

39 :23:01/11/24 05:37
追記
 ちなみに、pBR322 と pACYC184 の様に ori が違えば、2のステップでは
それぞれのプラスミドが8個づつになる。また、4のステップでは、分配され
たプラスミドの個数に関わらず、それぞれ8個づつになる。もちろん、最低1個
のプラスミドが含まれている事が必要。この場合も数学的に計算できるね。

40 :23:01/11/24 05:55
>>38 の応用問題。>>10 のレスに対応。

 2つのプラスミドで複製の効率が違う時にどうなるか。仮に、
プラスミドAと、プラスミドBの複製効率の比を、(1-b):b とする。
このとき、>>38 の答えがどうなるか。n 回分裂した時にプラスミド
Aだけを持った大腸菌が現れる確率・プラスミドBだけを持った大腸
菌が現れる確立をそれぞれ求めよ。
 また、n 回分裂した時、プラスミドAだけを持つ大腸菌・プラスミ
ドBだけを持つ大腸菌・両方のプラスミドを持つ大腸菌の比を求めよ。

プラスミドAは、空の pBluescript で、プラスミドBは insert が
入ったものと考えれば、>>10 の場合に相当する。

41 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/24 08:10
>28
通りすがりの者ですが、
マルチコピーのプラスミドの分配はランダムなの?
シングルの時みたいに何らかの分配因子は関わってるんでしょうか。
そういえばマルチの分配って良く知らんなと思いまして。

42 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/24 18:45
age

43 :23:01/11/27 05:27
>>41
少なくとも、pBR、pUC、pBluescript 等の ColE1 由来のプラスミドには
無いはずです。ori の機能としては、転写して出来た RNA が primer と
なるような DNA 複製の開始と、その逆鎖の RNA による promoter 活性制御
だけだったと思います。オリジナルの ColE1 にも分配因子はたしかなかった
はずですが、dimer plasmid を monomer にするための組換え部位があります。

44 :41:01/11/27 08:02
>23さん
久しぶりに覗いたらレスが!どうもです。
自分は学部生なんですが、どうもその辺の知識が無い。
20年前あたりの古典をひもといて勉強してみようと思います。

plasmidの分配もそうですが、原核生物染色体の分配も不思議な点が多いですよね。

45 :4:01/11/27 09:50
>>35
例えば、プラスミドをテンプレートにPCRで一塩基置換してDpnIでもとのテンプレートを消化してそのままトランスフォーメーションするようなキットがあるだろう。それを使うと一つの大腸菌にもとの鋳型と置換したやつと両方が入る可能性があるということ。

46 :23:01/11/27 10:20
>>4 >>45
 うーん。つまり、言いたい事はポイントミューテーションなら、それぞれの
plasmid を持った大腸菌の分裂速度が同じで、どちらかの plasmid にバイア
スがかかっているわけじゃないから、mixture が mixture のままで、>>10
で言ってるように片方の plasmid だけになるわけじゃないって事だと思うん
だけど。でも、たとえポイントミューテーションの plasmid 2つが最初に
入っても、何世代か経た後には、それぞれの大腸菌はどちらかしか持ってない
よ。どちらかしか持っていない大腸菌が2種類いて、その mix になってるだ
け。
 1 が見てたら混乱しそうなので、sage。

47 :とおりすがり:01/11/27 18:28
のシロウトですが、28の問いの答えが知りたい。
是非おしえてください。でなきゃ何かいい本紹介して。

48 :25:01/11/27 18:57
>>47
俺もw

49 :パーでんねん:01/11/27 21:20
28の質問への回答
何点ぐらいいただけるでしょうか?

1) TFされたプラスミドがシングルコピープラスミドである場合と、
マルチコピーである場合の分配のメカニズムに関する違いを述べよ。

シングルコピープラスミド、たとえば miniFプラスミドでは sopABC遺伝子
によるプラスミド分配機構により複製したそれぞれのコピーは娘細胞へ分配される。おそらくこれは均等分配によると考えられる。

一方、マルチコピープラスミドにはこのような積極的な分配遺伝子は見つかって
おらず、娘細胞へランダムに分配されていると考えられる。ランダム分配であって
も、細胞分裂に際して常に20コピーあれば100世代後でもほぼ100%の大腸菌で
プラスミドは保持されうる。

2)相異なる2種のプラスミドがひとつの細胞に入ったとして、
細胞分裂を繰り返しても常にその2種類が1細胞中に保持される場合、
どのような可能性が考えられるか? 少なくとも3つの例を挙げよ。

・このプラスミド間で複製制御の不和合性も分配機構の不和合性もない場合。
・2つのプラスミドの間で組換え反応が起こり、2種類のプラスミドが融合した
プラスミド分子(composite plasmid) になった場合。
・一方のプラスミド分子が宿主の染色体に組込んだ場合。
・2つのプラスミドが 個別のpost killing systemをもち、プラスミドを脱落させた宿主の増殖を阻害する場合。


3)ひとつのプラスミドが一分子内で複数のoriを持つ場合、
そのプラスミドの分配に関してどのような現象が観察されるか?

プラスミドのコピー数は、その複製開始頻度の調節によって行われている。
したがって、コピー数というのはその複製起点 oriの数ということになる。
すなわち、分裂時のコピー数が20という場合は、 oriの数が 20ということであり
分配されうるプラスミドの分子数を必ずしも反映していない。たとえば、ダイマー化
したプラスミド(一分子内に2個の ori)では同じ20コピーであっても、実際の分子
数は半分の10分子である。テトラマー分子では5分子でとなる。したがって、
ランダムに分配されるプラスミド分子の減少により、プラスミドを脱落した細胞の
割合が増える。

50 :23:01/11/29 03:23
28さんと1君は何処に行ったんだろう。

51 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/29 06:12
このスレ、いいね。
ひさびさに真面目な生物板のスレをみたよ。

52 :23:01/12/01 12:38
>>38-40 この数学、私には難しすぎる。39 が一番やさしそうだが。
だれか、数学の得意な人お願い。

53 :41:01/12/02 07:41
ageます

54 :とおりすがり:01/12/02 14:51
勉強になりました。age

55 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/07 14:05
Fプラスミドって種を越えて伝達されるんですかね?
HB101とDH5αF’からHB101F’を作ろうと思ってるんですけど。
っていうか、DH5αF’で増やした汚いpUCとインサートが入ったやつをHB101に入れたら
青と白のコロニーが出てきたんですけど、HB101ってlacZΔ15じゃないですよね。。
生物の人に聞いたらFみたいなでかいのはchemicalには入らないって言われたんですが。。
とにかく青くなるHB101がほしいので青いコロニーを拾ってプラスミドを落とさせるか
(って、どうやるんですか?とりあえずAm抜きで培養中。プレートにまいて白いコロニーを
拾えばいいんですかね?)プレートに生えたサテライトを増やしてみるつもりです。

56 :23:02/01/11 05:21
久しぶりにレスが。
>>55
 HB101 の genotype を見てみたんですが、lacZ- じゃ無いですよね。
という事は、pUC の lacZαなんて無くても青いコロニーになる気が…。
トランスフォーメーションせずに amp 無しでまいた事ありますか?
 ちなみに F' はちゃんと別の大腸菌に入ります。普通にアルカリ-SDS
で miniprep します。電気泳動してもバンドは見えませんが、この solution
を用いてカルシウム法で別の菌に入りますよ。XL1-blue の Tet の入った F'
あたりが selection が簡単で良いと思いますが。DNA のサイズは大きくても
supercolied ならかなりコンパクトになるから大丈夫なのでしょう。

>>49
 28 さんの質問の真意がすべて分かるわけではないので何ともいえませんが、
そんな所だと思います。私が知らない情報もありますし(笑)。28 さん、戻って
きませんね。

57 :帰ってきた28:02/01/11 09:57
すまん、このスレのことすっかり忘れてた。ageてくれてありがと。
自分で質問投げておきながら、なんと無責任な。ワラ

>>49
俺ごときの採点を待つまでもないでしょ。すばらしいの一言に尽きる。
俺が指導教官なら、二人で組んでラボ立ちあげて、バクテリアの遺伝学を
極めたいね。もっとも俺の専門はもう分子遺伝学じゃないので、働くのは
君の方だが。かわりといっちゃーなんだが、英語書きはまかしといてくれ。
おっと、2=6=8=23もリクルートしとかないとな。久しぶり。>>23

一応講評しておくと、1)については言うこと無し。

2)については、正直、2番目のプラスミド融合については思い付かなかった。
4番目は、なにもPSKまで持ちださなくても、別々の薬剤耐性遺伝子を載せておけば
両薬剤入りのプレートで強制的に維持させることが可能だよ。
例えばpBR-ampとpBR-kmみたいに。まあ強制保持って意味で本質的に同じ事だけど。

最後の3)だが、これも予想以上の回答で結構。最後の一文が効いてるよな。
ただ、実は別の回答も予想してたんだけどね。
大昔の仕事で、FとP1のoriginを一分子中に載せたプラスミド知ってる?
いわゆるdicentric plasmidって奴。酵母でそれやると細胞分裂時にちぎれ
ちゃうんだけど、大腸菌では何事も無く分配されるという。
ま、はじめに大腸菌の場合のみって断ったから、気にしなくてもいいよ。
回答ご苦労様。長いことほったらかしにしておいてごめんね。

58 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/14 00:38
これって、古典的な意義がどうとかって言うより、私らにとっても結構マジ
な問題よ。例えばPCR産物をクローニングする時のこと考えてよ。PCRのサイ
クルの最後の方って、基質も足りないし酵素もへばってるからほとんど増幅
されなくって、変性>アニール>変性>アニールのサイクルを繰り返してる
でしょ(29サイクルめと30サイクルめで産物が2倍にはならないよね)。そ
うすっと、PCRで入ったmutationはほぼ全てがhetero-duplexになるわけよ。
このPCR産物をベクターにライゲーションしたものを大腸菌にTFしたら、複
製と修復の競争で、修復されるより先に複製されたら、1 base違いの2つの
プラスミドが1つの細胞内にあることになるでしょ。これって、結構ヤバい
状況で、最初のミニプレだと変異型がほとんどでも、large prepしたらもと
の配列のものばっかりになったりするよ。これ、経験あり。

59 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/26 00:24
これってどうよ。

60 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/26 00:34
うちじゃ、同じ理由でPCR産物をクローニングしたら、そのミニプレップ
を再トランスフォーメーションしたものでシーケンス確認してる。

61 :思想警察:02/03/05 20:46
みんなよく知ってるなあ。俺も勉強しよ。

62 :黒ムツ:02/03/11 12:52
くだらん。

63 :55:02/04/03 15:02
>>56 はい、全部青くなりました。そうか、LacYってLacZとは違うんだ。(笑)
ただ、青くなってくるタイミングに差があって、白いやつをつつけばだいたい中になにか入ってました。
αペプチドがあると活性型β-Galの会合が促進されるんですかね?あと、白いやつはコロニー密度の
低いところから青くなってきて、これはインタクトのやつと逆の挙動でした。
というわけで、LacZ+でも青白選択は可能なこともあるようです。

64 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/18 17:36
C/EBPαとPCXIZの塩基配列知ってる人いたら教えてください。
あまりに情報がなくって困ってるもので・・・

65 :23 改め KAT:02/04/24 06:23
C/EBPα
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=nucleotide&list_uids=4757971&dopt=GenBank

PCXIZ が何かわかりません。

ちなみにC/EBPαは PubMed で2分で検索できました。自分で調べましょう。

66 :名無しゲノムのクローンさん:02/05/03 16:50
ありがとぅ!ございます。でもね、でもね、自分の持ってるのは1188bpなのです。
やっぱ、人とラットは違うのかなあ。

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