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マススペクトロメトリー

1 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/04 07:01
マススペの原理はもちろん、実際の手技についてさっぱりわかりません。
最近は特定のタンパク質でIPして、クマシーで染めてマススペして
結合蛋白を同定したり、一気にリン酸化など修飾されているサイトを同定したり。エキスパートの方、詳しく教えてくれませんか?

2 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/04 11:53
マス*ー****ンならエキスパートが大勢いるのになあ。(おしい)

3 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/04 12:28
掲示板で詳しくは無理だろう。
自分で文献当たる方がいいでしょう。
実際の手技も、ということであれば、ちゃんと参考文献を入手した方がよいのでは。
Mannとかの原著論文でもいいけど、今は日本語の解説がいっぱいある。
細胞工学とかにも載っていたと思う。

4 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/04 12:29
マスをかくのは得意です。
何でも聞いてね。

5 ::01/12/04 12:42
ところが今は在米中で、いろいろ文献もあたったのですが
英語しかないというのと、いったいどれが自分にとって重要な
方法なのかというので挫折しています。
マススペそのものは業者がやってくれるのですが、そこまでの処理と
指示の出し方がさっぱり。

6 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/04 13:57
化学屋に聞いてみよう!

7 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/04 15:06
うだうだ言うなら共同研究しなさい。

8 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/05 01:24
PAGEサンプルのシークエンスはPVDF膜に転写してからプロテインシー
クエンサーでえどまん分解するのが従来の同定法ですが,MSを使うのが最近
のはやりで高感度です。PAGE上のたんぱくバンドをかみそりで切り出して
からトリプシン,V8などのプロテアーゼで消化して,オリゴペプチドにし,
それのMASSスペクトルをとります。そうするとそのオリゴペプチドの正確な分
子量がでます。MS/MSのスペクトルをとる,つまり最初のMSのイオンに,
さらに電圧をかけるとペプチド結合が部分的にランダムに開裂するので,それ
の分子量を測定するとアミノ酸配列までわかるのです。データベースでその配
列を検索するとアミノ酸配列既知のタンパクなら,ペプチドがどのタンパクの
どの部分なのかまで同定できます。

9 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/05 01:26
>4
一番気持ちよくなれる技を教えて下さい。

10 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/05 05:37
>>8
なるほど・・原理はよくわかりました。具体的なプロトコールが載っている
文献があれば教えて下さい。

11 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/05 11:16
教えてクンうざい
礼くらい言ったらどうだ

12 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/05 11:40
お、これは忘れていました。
>>8
どうもありがとうございます。よくわかりました。

13 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/05 16:22
トリプシンの加え方や、ペプタイドの濃縮、精製などできれば横に座ってエキスパートの
操作を見るべきだと思います。
たんなる実験手法に過ぎないので、ヒトに教わったほうが早い。

14 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/05 17:57
Jensen ON, Wilm M, Shevchenko A, Mann M.
Methods Mol Biol. 1999;112:513-30.

http://depts.washington.edu/~ruedilab/aebersold.html

15 : ◆/AYAKOXE :01/12/05 19:53
>>9 シャブってトリップしてさすってするのがいいのでは?

16 : :01/12/29 05:18
一般的にPAGEしてクマジー染色が多いと思うのですが、銀染色でも可能なのでしょうか?

17 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/10 23:38
>>16可能です。
修飾しないように改変したプロトコールがあります。
MSは感度的にはfmolあればできるらしい・・・。

18 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/11 00:25
>17
fmolはうそです!
まあ装置メーカーの営業や、マスが広まると利益をうける
専門家先生方はよく風呂敷をひらげますけど。
実際にfmolで依頼分析やってるところなんてないでしょう?
大体素人がいきなりF1マシンのったって300km/hなんて
出せないでしょう?それと同じ。

19 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/11 00:30
迷わず外注。これが実は一番安上がり。

20 :16:02/03/14 17:55
あ、久々の回答ありがとうございます。
要はテクニックの問題と言うことですね。

21 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/14 18:48
>>19
マスの外注でアミノ酸配列の分析までやってくれる企業って
あるんですか?
あるんだとすれば、安いとこ教えてもらえないでしょうか?

22 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/14 21:34
なんでマスは「飛ばす」っていうの?

23 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/15 01:05
>>22
分子がイオンになって飛んでゆくからです。
なんで電気泳動は「流す」っていうの?
と似た質問かもしれません。


24 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/15 18:03
マスの感度って実際のところいくらくらい?

25 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/15 19:05
MALDIとかESIとかFABとかあるけどどれが一番使える?

26 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/15 19:37
>24
敏感です。


27 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/16 01:14
>23
マジレスかよ。どう見ても22はネタふりだろ。
俺に任せろ。
>22
だいたい平均で1mは飛びます。
1週間ぐらい我慢して、角度もうまいことしたら2mは越えるよ。自信あるよ。

28 :オシエテくん:02/03/19 01:49
Zip Tip のうまい使い方教えてください。
とくに洗いと溶出。

29 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/19 01:55
って吸って吐くだけじゃん。
何をそんなに困るのだ?
あ、そうそう「ゆっくりやること」かな。

30 :オシエテくん:02/03/19 02:28
>29
やり方が悪いのでしょうか?
いつもフィルターから完全に溶出してないような気がします。
(ちゅーか、完全に出てなかった!)
一発濃縮溶出結晶化法はないですか?

31 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/22 18:06
>>30
微量ならZipTipが一番マシっぽいが、当然ロスはあるでしょ

で、「溶出してない」つーのはEluteしてない、っつー事なのか
単に液がチップに残ってるっつー意味なのかをまずは教えれ

32 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/22 18:12
 銀染は回収率が悪すぎんか?
 しぷろるびーの方が使いやすい様な

 でも結局くましーの感度とMSの感度ってなんとなく似てるので
くましーを使ってる
 もしかして俺がヘタクソなだけ?

>23
 2m?もっと飛ぶが?
 高い機械なんだし、もうちょっとちゃんと考えてあるだろ
 角度とか

33 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/22 18:38
どんなおとがでますか

34 :ターボ:02/03/22 19:02
きーん


35 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/22 21:43
きーんでございまーす

36 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/22 21:53
どぴゅ

37 :オシエテくん:02/03/23 02:01
>>30師匠
エリュートです。
一度エリュートして、同じチップで再度エリュートして、
それぞれを別々にマスにかけると、
2度めのエリュートにもピークが出るんです。
ペプチドの濃度を薄めず一気に出せないもんですかね。
現在フェムト目指して(あと少し)、日々精進中です。

それとチューブとか黄チップ青チップは特別なの使ってますか?

>32
銀染の回収率が悪いって、
ペプチドがクマシーとかよりもゲルから出てきにくいってことですか?
ペプチドがゲルにくっついてしまうんですか?


38 :31:02/03/23 22:36
>>37
それは・・・しょうがないかも
2回溶出するか、溶出物を2・3回ピペッティングしてやるくらいしかないっしょ
MALDIならプレート上で乾燥させれば2回分程度の溶出液なら濃縮できるけど・・・

チューブやチップも重要ですが、液が触れている時間が長いとすぐ吸着するので注意の事


39 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/23 22:41
銀染だと回収率が悪いのはなんでだろうね
銀杏反応のせいだとかも聞くけど
酵素で切れにくいのが問題なんだと思う

CBBだと脱染の時に色が見えてわかりやすいというのも利点かも

40 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/27 17:33
今月号の細胞工学に銀染キットとお手製銀染での比較が出ていたけど、やっぱりキットだとピークが低いみたい
銀染キットよりもサイプロルビーの方がきれいにピークが出るようだ

41 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/27 17:42
==2==C==H======================================================

         2ちゃんねるのお勧めな話題と
     ネットでの面白い出来事を配送したいと思ってます。。。
===============================読者数:102115人 発行日:2002/03/12
どもども、人格障害者のひろゆきですー。
今日は重大なお知らせがありますですー。
これまで2chでは、企業に対する真偽の曖昧な書き込みは削除しませんでしたが、これからは削除依頼が出たら一旦全て削除して、その真偽をおいらが責任を持って調査し、真実であると確信した時点で改めて復帰させ公開することにしましたですー。。。
これまでは企業に対して、書き込みの内容が嘘であることを「証明してみろ」という傲慢な態度を示してきましたが、これからはおいらが書き込みの内容が真実であることを証明してから大衆の目に触れさせることにしますですー、、、
いやぁ、よく考えると始めからこうするのが当然だったのかも知れませんねー。。。

ちなみに最近はDHCの裁判の模様をお伝えしてますが、それも話半分で聞いていてくださいー、、、
おいらは相手側の主張の極一部を抜き取って、自分の都合の良いように歪曲して報告してますが、その前後の話も含めれば本当は全く違う状況なんですよー、、、えぇえぇ、、、
おいらってば本当に卑劣な人間なんですよー。。。
向こうの弁護士さんも相当に怒っていると思いますですー。。。

ついでに言っておきますが、DHCの件もこれまでと同様に旗色が悪くなったら報告するのを止めますので予めご了承くださいですー、、、
本当は結果まで全て真実を報告して、もし削除するよう決定がくだれば、相手側の企業に対する謝罪のひとつでも掲載するべきなんですよねー。。。
おいらってば人格障害者なもんで許して欲しいですー。。。

んじゃ!

42 :MSメーカーエンジニア→研究員:02/03/27 19:09
生物系へのMSについての情報はプロテオーム関連の本をごらんになるのがもっともいいと思います。
MALDIは一般的には混合物は苦手。でも1つのタンパク質をトリプシン消化した
混合物は既にデータベースで登録されている可能性があります。定量には
オススメではありません。定性が主。

ESIやFABは分離手段であるHPLC(LC)のディテクタとして付けていると思われるほうがいいと思います。
ESIは多価イオンが出ますので高分子のタンパクも限られたマスレンジでできますが
FABは一般に多価イオンは出ません。LC/MSは定量・定性ができますが、ある程度の
熟練が必要です。

MSについての板は化学にもあります。ここでは環境関係について幾らか出ていた
と思います。


43 :MSメーカーエンジニア→研究員:02/03/27 19:17
ついでに

MSは
・導入部(直接サンプルを何かに塗って入れるかガスクロや液クロで分けて入れるか)と
・分析部(二重収束や、四重極(Qマスといわれる)かイオントラップなど)と
・データ処理から成ります。

イオン化は試料を分析部に入れる前に行ないます。分析部は高真空です。
そこには磁場や電場がかかっています。そのためイオン化しているもののみが
理想的には正しく決められた挙動で動き(語弊があるけど)、検出部に
到達して、そのイオン情報(見かけの分子量/電荷=m/z)を与えます。

これがスペクトルです。分析部を飛行することから飛ばすという言葉が
あると思います。

44 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/27 19:24
うわっ、なんだか参考になる書き込みだなぁ。

45 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/27 21:36
 MSメーカーはぷりておーむとちょい距離があるトコが多い様な
別に>>42>>43氏に関して言ってるワケではありませんが

 DNA配列をたんぱく質のアミノ酸配列データベースとして利用
できる場合(つーか普通そうだが)、DNAの全配列が決定されてい
るイキモノのたんぱく質は実質上全てデータベースに載っている事
になります。いや、イントロンとかあるから実際はちがうんだけど
さ。

 一般的には、ヒトのDNAも配列自体は決定されているので(ア
ノテーションはまだまだだけど)、ヒト由来のたんぱく質もデータ
ベース化されている、と考えて解析している事が多いと思います。


 ちなみに酵素消化物の場合、ペプチドマスフィンガープリンティ
ングだけでの解析よりもMSMSによるフラグメンテーション解析
の方が最近は主になりつつある様な気がしますね。ハイブリッドマ
ス(QqTOFやTOFTOF)もうちょっと安くならないかなぁ。


46 :45:02/03/27 21:43
 そーいえばMALDIは他のマスに比べれば混合物に強く、塩な
どに関しても他のマスから見ればキツい量でも測定できる、と思う
んだけど、>>42氏は違うご意見の様で。混合物に強いマスって何で
しょうか。LC−MSで、LC分離すれば混合物もOKとかだった
りして。

 MALDIが定量に向いていないというのはその通りだと思いま
す。スポット全域をたたいて積算すればあるいは・・・という気も
するけれど、実用的じゃないしね。


 つーか、ICATはどうよ?


47 :42-43:02/03/27 22:31
>>45-46&MSにご興味のある皆様

混合物に強いというのはLCで分けてという意味です。すみません。
(誘導体化してGC/MSってのもアリか・・・)
フローインジョクションで突っ込んだらどうか??って言われますと
たしかにデータベースの関連上消化物ならMALDIでいいとのこと。

ICATって、安定同位体を利用したアプライドさんの試薬のことですよね。
8マスの差で定量するとのこと。あれは分解能がないと使えないそうです。
つまりアプライドさんのMSでもAPI4000ではダメ。QSTAR(QQQTOF)でないと
使えない。それにしてもハイブリッドはアプライド、マイクロマス、ブルッカ
共に高いね。(定価で1億近い・・・・)

あと分解能を絞ることができるイオントラップでもICAT使えると
某研究所の先生からお伺いしました。実際に小生が使った訳ではないですが。

定量にはやはりスポットを当てるタイプのMALDIはオススメではないそうです。


48 :45:02/03/28 19:19
>>47
マジメだねぇ
なんで2ちゃんにきてんの?

情報どうもです。イオントラップでICATか・・・
ちょい盲点だったかも。イオントラップならあんまり高くないしな
試薬が高いけど(涙

49 :MSメーカーエンジニア→研究員:02/03/28 23:07
ども。実は前社(MSメーカーというよりは電気大手)の裏事情覗いたついで・・。
ここに来てしまいました。

それは置いといて、アプライドのMSを買ったときに限り(QSTAR)試薬も
おまけで付けてくれる約束はしたのだが、試薬だけでも売ってくれる。高っ!だね。

それよりサイファージョンの相互作用→MSってやったヒトいるの?
意見結果希望です。


50 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/29 16:06
これから買います。どこのがいいのでしょうか?

51 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/29 16:37
>>50
この板ならプロテオームに使用するんでしょうか
サーチエンジン用の予算も取りましたか?

PMFだけなら各メーカーの差は小さいですが、ハイブリッドは結構違うと思います。
具体的に何を条件に検討してるんですか?

52 :MSメーカーエンジニア→研究員:02/03/29 19:21
>>50
>>51さんのおっしゃるように何に使うかが問題です。
それと何処に置くか、また共通機器として使うかも案外重要。

共通機器なら誰か代表(責任者)として置かないとMSは難しい。
MALDIなら比較的楽ですが、責任者ナシで共通機器としてLC/MSを置くのは
今までお付き合いしたユーザーさんからの話でも凶・・・。

また薬物動態や環境分析が主用途ならESIやMALDIよりもLC/APCI-MSのほうが吉。

53 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/30 01:04
>51,52
ありがとうございます。サーチエンジンとは?データベースソフトのようなものでしょうか?
プロテオームに使用するため、MALDIを購入するようです。標準的なスペックだと、いくらくらいかかるのでしょうか??


54 :51:値段はテキトーかも:02/03/30 09:16
>>53
 マスのデータとたんぱく質の配列データを比較して、たんぱく質を同定するエンジンが
サーチエンジン。MASCOTやProteinProspectorが有名。これがないと、ただの質量分析しか出来ん。

 MALDIでPMFするだけなら(MALDI-TOFなら)4千万から5千万もあれば大丈夫かな。
MSMS解析するハイブリッドのMALDI-TOF/TOFなら8千万くらい?もうちょい?

 サーチエンジンはインターネット経由でよければタダ。買うと・・・ピンキリ。
ソフトだけで50万程度、からサーバー構築込みで数千万まで・・・。

55 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/01 12:19
とりあえず上げとくか

56 :MSメーカーエンジニア→研究員:02/04/17 23:45
ageます。

57 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/18 12:39
TOFTOFってどうよ?どうなのよ?

58 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/18 12:46
現在、マスを使った生体試料中の蛋白定量って、
役に立つくらいになってるの?

59 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/18 20:11
>>58
絶対定量はツラいと思われ
比較定量は・・・どうだろう・・・

60 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/18 20:18
>>59
では、メーカーの説明資料にあった、
血清中のインシュリン定量もあやしいのかな?

確かに、検量線とかの詳しいデータは一切なかったが。

教えて君で、スマソ。
明日にでもちょっと調べてみる。

61 :MSメーカーエンジニア→研究員:02/04/18 23:52
勝手な意見、高いカネはらってICAT使うんだったらCBBとかローリーとかBCA使うわね。
昔(メーカー時代)、タンパク質をESIで測定して、多価イオンの強度、足して定量
できるか凝ったコトあったけど、玉砕しました。

あっTOFではICATの定量は難しいよ。
それとタダのQMSでも分解能が悪いのでICATの定量は難しいよ。

62 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/19 09:55
>>60
んあ。どこの資料かな?つーかどのタイプのMSか教えて
定量性はイオン化法に大きく依存するからなぁ・・・

そーゆー定量はほとんど前処理で決まる気もするけど

63 :MSメーカーエンジニア→研究員:02/04/20 00:31
>>57 TOFTOFってどうよ?どうなのよ?

こりゃ、ウチはお手上げ。TOF持ってなかったもんね。
先日きたABIさんはTOFはポストソースディケイ(PSD)を衝突(MS/MS)のように使うと
言っていましたが、これをもっとシッカリさせたものか?ゴメンナサイ〜。

どなたかhelp!


64 :60:02/04/20 00:37
メーカーは Waters。
今日は担当者不在のため、だめだって。
MS の種類は不明で、標識して定量するので、61 さんの方法かな。

抗体が市販されていないので、ELISA や SPR バイオセンサーに頼れず、
MS はどうかなーっと思っている所です。

え、精製してポリクロ作れって?
作れるかな???

65 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/20 13:07
うちはMicromassのQ-TOFあるけど、結構いいぞ。
MS/MSでばっちりペプチドのシークエンスまで読める。
既知タンパクであればDigestion => LC/MS/MSで全シークエンス
確認可能。
できればTOF-TOF欲しかったが、当時は出てなかった(泣)


MALDIのPSDは正確にはMS/MSではないから、あんまり
使いもんにならん。(ABI Voyager使用)
あと、VoyageのPSDは測定が面倒。

66 :MSメーカーエンジニア→研究員:02/04/20 14:11
>>65 さんは詳しそうですね〜。助かります。
>>60-64さん、もしかしてWatersといってもmicromassの製品ではないでしょうか?
(たしか提携していたと思いましたが)
そこのK井さん、澤○さんは優秀なアプリケーションエンジニアです。

抗体がない場合のタンパクの定量は「S35でラベルして、SDS-PAGEかける」のって
ダメかなあ?細胞刺激の差による発現の差はそれでみれそうですが、分子量の
似たタンパクや膜タンパクならまだ難しいです。

67 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/29 19:10
ねーねー銀染って回収率悪いの?
なんで?

68 :MSメーカーエンジニア→研究員:02/05/03 01:14
エンジニア時代はここまでMSが生物に使われていなかったので、実感としてまだ分からない。
同僚の元NAISTにいた人からそれとなく聞いたところ、銀染色は回収が悪いのではなく
(実際感度はクーマシーよりも1桁近くいい)MSにかけるときにイオン化効率が悪いらしい。
ESIでの感度の低下→きっとイオン性の夾雑物が多いと思われる。グアニジン系の
モノが悪さをするとその人はおっしゃっていたが、文献はまだ調べていない。
スミマセン。

69 :名無しゲノムのクローンさん:02/05/04 00:29
通常の銀染はグルタルアルデヒドで架橋をするのですが、これがイオン化効率を下げるらしい。
グルタルアルデヒドで架橋しないと感度が下がる。
マス用にグルタルアルデヒドをつかわない銀染キットもあるね。

70 :名無しゲノムのクローンさん:02/05/04 22:24
グルタルアルデヒド使うとペプチドのマスが変わってしまうかと
チオ硫酸ナトリウム使わなきゃ・・・
確かに染色法としての感度は下がるけどね

>>68
ESIで夾雑物・・・シリンジポンプで分離せずにイオン化させてるんでしょうか
ケミカルバックグランドが高いとかの話かなー

71 :70:02/05/04 22:29
あ、sage進行でもないのに下げてしまった

個人的にはサイプロルビーが総合的には優れている様な気がする
バンドを回収する時に自然光下肉眼で見えないのがツラいけど

あと、高いw

72 :68:02/05/05 00:39
グアニジン→グルタルアルデヒドの間違いです。スミマセン。ESIの夾雑というのは
シリンジポンプで入れるのでなく、インジェクト法であっても、溶いてるBuffer
によってイオン化効率に差が出るということです。

約10年近く前の話ですが、酵素消化ではUreaを使わないで、炭酸アンモニウム
使ったこともあります。

>>70氏のおっしゃる通り、実地で慣れている人はルビーがいいと言っていました。
そのため現在こちらでは「上手く分けられるか」、当りをつけるまでの実験は銀、
本番の回収にはルビーを使おうとしています。

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