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  「実験の裏技ありますか??」2   

1 :名無しゲノムのクローンさん:2001/07/30(月) 19:53
パート1はこちら
http://cheese.2ch.net/life/kako/972/972458683.html

2 :eyelessoidex:2001/07/30(月) 22:18
32P の汚染は、リン酸バッファーで見事に落ちる。どんな洗剤よりも強力に。
放医研に国内留学していた時に教えて貰った。

3 :名無しゲノムのクローンさん:2001/07/31(火) 23:33
出尽くした?

4 :名無しゲノムのクローンさん:2001/07/31(火) 23:39
AB○のシーケンスキット、反応スケール1/4、さらにTaq用バッ
ファーで1/4に希釈して反応してる。推奨プロトコルの1/16量
で400bpぐらいなら問題なく読める。

5 :名無しゲノムのクローンさん:2001/07/31(火) 23:42
>>2 競合するんっすか。

6 :eyelessoidex:2001/08/01(水) 10:10
まじで汚染が取れるんだから。だれか興味ある人はメカニズムを考えてみてちょ。

7 :名無しゲノムのクローンさん:2001/08/02(木) 07:32
age

8 :名無しゲノムのクローンさん:2001/08/07(火) 01:28
age

9 :名無しゲノムのクローンさん:2001/08/13(月) 05:24
リアルタイムPCR SYBR Green、2/3スケールで問題なし。

10 :名無しゲノムのクローンさん:2001/08/13(月) 15:51
>>9
うちでは1/2だよ。業者がそのほうがいいって。

11 :10:2001/08/13(月) 16:02
9600なら1/8でできるって。

12 :名無しゲノムのクローンさん:2001/08/14(火) 10:14
>>10
25microLのスケール?
>>11
6 microL?

13 :10:2001/08/14(火) 11:44
>>12
そう。テンプレートもプライマも水もマスターミックスも半分。
温度を設定する画面で50μを25μに変更するの。

9600の話は業者が言ってたので未確認だけど、
6μスケールじゃかえって面倒そうだよね。
だから、Taq用のバッファーを使って、20μスケールくらいにするのでは?

14 :名無しゲノムのクローンさん:2001/08/14(火) 12:33
元スレ立てた人の名前、14-3-3って…
都立大磯辺研か?
皆さん、おげんきですか〜。

15 :名無しゲノムのクローンさん:2001/08/16(木) 12:08
ピペットチップもエッペンドルフチューブも
オートクレーブしない。
エッペンドルフチューブはオートクレーブしないと
キャップがゆるいのがあるから要注意だ。

16 :名無しゲノムのクローンさん:2001/08/22(水) 04:38
電気泳動の裏技ないですか?

17 :名無しゲノムのクローンさん:2001/08/22(水) 13:19
age

18 :名無しゲノムのクローンさん:2001/08/22(水) 18:38
Big-Dye Ver3の使用したいますか?
使った感想をきぼんぬ

19 :名無しゲノムのクローンさん:2001/08/22(水) 18:41
全部プロトコールの1/100にすりゃー、研究費1/100で済むよ。
100万で1億の実験ができるんだ。
PCRなんて50μじゃなくて0.5μでやるべきだよ。

20 :名無しゲノムのクローンさん:2001/08/22(水) 18:42
研究費デノミ政策

21 :名無しゲノムのクローンさん:2001/08/22(水) 18:43
>19
絶対無理。

22 :名無しゲノムのクローンさん:2001/08/22(水) 18:48
9600シリーズなら0.5μも可能だが、特殊なピペットと特殊な
チップが必要。

23 :名無しゲノムのクローンさん:2001/08/22(水) 18:52
結局、計測技術の進歩で研究費のコストは大幅に減らせる。
そう考えれば、ピペットの技術がバイオの未来を左右する。

24 :名無しゲノムのクローンさん:2001/08/22(水) 19:17
>>19
50は無理だが、10ならいける。
…1/5じゃだめ?

25 :名無しゲノムのクローンさん:2001/08/22(水) 19:19
研究費1/5になるのもかなりデカイな

26 :名無しゲノムのクローンさん:2001/08/22(水) 19:19
実験の基本は面積の少ない96穴

27 :名無しゲノムのクローンさん:2001/08/22(水) 21:01
うち基本的に1.5mlのチューブ使ってるんだけど、よく考えりゃ制限酵素
切断もライゲーションも100microL以下の容量。これなら操作は0.2mlチューブで
できる。ならば遠心機他の規格を0.2mlに合わせて酵素反応のたぐいは全
てサーマルサイクラーで、なんて考えてみたんだが、どうでしょ。

28 :名無しゲノムのクローンさん:2001/08/22(水) 21:35
>>27
すでにそうしているよ。
0.2のチューブも1.5のチューブに入れたら遠心できる。
サーマルサイクラーを4度にしとけば氷もいらない。

29 :名無しゲノムのクローンさん:01/08/27 00:52 ID:AvxWk81A
96穴のプレート洗ってつかってます?

30 :名無しゲノムのクローンさん:01/08/27 15:37 ID:L6hbd1xg
>>27
1.5ml tubeより0.2ml tubeの方が単価が高いのでは?

31 :名無しゲノムのクローンさん:01/08/28 16:20 ID:hke42o/k
電気泳動裏技(DNA)?
Mupid等の場合、急ぎのときは蒸留水をいれると
泳動が早くなります。が、抵抗が上がるので
熱も出るしMupidだとヒューズ飛ぶかも。

32 :名無しゲノムのクローンさん:01/08/28 16:24 ID:jMYaaY6I
チューブの単価
1.5ml>0.5ml>>>>>0.2ml

33 :名無しゲノムのクローンさん:01/08/28 21:53 ID:zdYAiWSY
マジで、高いの?

34 :名無しゲノムのクローンさん:01/08/31 22:45 ID:QJWiqVRg
0.2mLチューブの方が高いよ
1.5mLチューブを使う方が経済的

35 :名無しゲノムのクローンさん:01/09/03 03:58 ID:XQKgeI5k
あげ

36 :名無しゲノムのクローンさん:01/09/04 00:25 ID:8..hgPYo
>>31
蒸留水入れたら泳動遅くならない?
うちじゃ全く逆だ。蒸留水入れてバッファー希釈
した方が熱も出ないし・・・なんでだろ?

37 :名無しゲノムのクローンさん:01/09/04 00:46 ID:kFfewe52
暗室で縦四方固め

38 :31:01/09/05 12:15 ID:KE8KnUfg
>>36
オームの法則だと、抵抗を上げると電圧一定なら電流量も減ります。
だから泳動が遅くなるはず、なんですが(電気系は小学校レベルの
知識しかないのでよくわかりません)、mupidもしくはgelmateでは、
反対に流れるのが早くなる、と聞きました。というか、薄まってるの
とは違うかも。もしくはゲルは抵抗が少ないから電流が逃げる?

実際に使用していた状態の実況。
mupid等で、1×TAEで普通に泳動→数枚泳動後もしくは数日後、
泳動しようとしたら干上がっている→ゲルを入れ、沈むくらいまで
洗瓶から蒸留水足す→ついでにウェルも洗う(一石二鳥)→繰り返し。
とやっている間に、泳動が早くなったというワケ。

39 :36:01/09/05 23:52 ID:oUocUpDQ
>>38
うちも大体同じで最初は1×TAEだけど蒸発した分だけ蒸留水を
足していってる。で、段々と発熱も減るし、泳動も遅くなる。

ただ完全に蒸発させたことがないからその辺が問題なのカモ。

40 :31:01/09/06 11:30 ID:r6zeNgpA
>>39
ムムー。
物理出身者が「速くなる説」を唱えてたので、何か根拠があるかとも
思ってたんですが、無さそう。でも確かに速くなってたというのは、
bufferの組成かなにかが微妙に違うのカモ。
つーか、すっごい熱くわなりましたデスよ。根拠無いので、この辺で。
裏取れた裏技でなくてスンマセン。

41 :36:01/09/07 00:00
>>40
なんか不思議だね。
解決は出来なかったけど研究室によって全く逆のことも
起こり得るということを知っただけでも楽しかったよ。

42 :名無しゲノムのクローンさん:01/09/07 00:48
ふつうは蒸留水入れたら泳動遅くなるだろうが。
TAE成分の電解質が多いほど抵抗は低くなるから、電流は多くなる。
蒸留水入れたら泳動層断面の面積あたりの電解質が減って、抵抗値が上がる。
よって泳動はおそくなる。

43 :名無しゲノムのクローンさん:01/09/07 11:15
age

44 :単細胞:01/09/07 11:41
電気泳動は電流より電位差でしょ?
バッファ濃いと電圧が低くなるんじゃないの?

45 :名無しゲノムのクローンさん:01/09/07 14:36
>>44
mupidのスイッチになんて書いてある?

私はbuffer量が多いときは遅いような気がしてるんだけれど。
何となくだけれど。

46 :単細胞:01/09/07 14:54
>>45
なんて書いてあるの?
バッファが多いと遅いのと(電流が多く流れることで)電圧が
低下すると遅いのはconsistentだと思うけど?

47 :黒ヤギさん:01/09/08 23:54
>>46
45が言いたいのは、「mupidは定電圧電気泳動装置」ということでは?
たしか50Vと100V。

ところで、通常より薄いバッファーに、通常濃度のバッファーを含むゲル
を入れたら、はじめのうちはゲルの中を優先的に電流が流れるようになる?

平行に流れないだろうから、像はきたなくなると思うけど。

48 :ラボドランカー:01/09/10 00:37
裏技と呼べるようなものではないが。

SDS-PAGEで使う2xサンプルバッファーを4xサンプルバッファーに
してアプライ量をかせぐ。サンプルが薄いときに有効。

微量超遠心でのバランス合わせは、電子天秤でチューブの重量を量り、
ピペットマンでバッファーを足す。
0.1 g増やしたかったら、100 uL足すという具合に。
面倒なのでバッファーの比重は1。一応、上皿天秤に乗せて最終確認はする。

49 :名無しゲノムのクローンさん:01/09/10 00:49
>微量超遠心
セシクロのシールチューブの超遠心って、重量きっちり量ってます?
DNA/RNAを溶かして、0.01g単位できっちり量ったセシクロを入れて
終わり。
あとはチューブの首の辺りまで入れてシールだけど、目測です。
また、タンパクの短時間超遠心(S100等を取る時)も、リシスバッファーでリシスして、
バランス用にリシスバッファーを等量加えるだけ。cellのvolume位大した事はないけど。
それで100000rpmで20時間回したりするんだけど、インバランス出た事ないな。

50 :おさかなくわえた名無しさん:01/09/10 01:06
>>49
20時間が短時間ですか・・・

51 :ラボドランカー:01/09/10 01:47
>>49
確かに、セシクロのシールチューブは>>48 のような方法では
やっていません。バランスの合わせようがないので。
上皿天秤に乗せて確認はしていますが。

そういえば、最近はDNAのペレットを直接 50 w/w% CsCl TE溶液
に溶かしています。横着するようになったなぁ。

52 :名無しゲノムのクローンさん:01/09/10 03:34
>私はbuffer量が多いときは遅いような気がしてるんだけれど。
何となくだけれど。

サブマリン泳動層でしょ。
ゲルの置いてある部分の断面を考えればわかるでしょ。
液が増えれば、ゲル内への通電量が相対的に減るからだよ。

53 :45:01/09/10 05:58
>>47
そういうことです。

>>52
????
私はMupid使ってます。電圧は常に一定なのでbuffer量がふえると
相対的に電流下がる、って解釈してるんだけど・・・。
そういうことなの?
チュボンヌにも解るように解説キボン。
スマソ。

54 :おさかなくわえた名無しさん:01/09/10 07:56
わたしゃbufferの濃度の影響だけかと思っていた
液量でそれだけ違うのなら、8レーンのゲルと17レーンのゲルでは
かなりの速度差が出ると思うぞ

55 :名無しゲノムのクローンさん:01/09/11 00:14
>54

なんで???
サブマリンでゲルの上にバッファーがギリギリひたひたの場合と、
たっぷりと層から溢れるほどある場合では、泳動速度が違うだろ。

ギリギリの方が泳動速度は早いけど、発熱がすごかったり、
きれいに流れなかったりする。
たっぷりだと、きれいに流れるけど、遅い。
バッファーが循環することで、ゲルの冷却機能も果たしているからね。

56 :名無しゲノムのクローンさん:01/09/11 00:26
素人だけど考えるに、
E=IRにより、バッファー量が多ければ抵抗値が下がるので(管が太くなる)、
定電圧なら総電流量は増えますね。
しかし上層のバッファーへの通電(逃げ?)が増えますから、ゲル内通過する電量も減るでしょうね。
上がる総電流量とで相殺されそうに思いますが、実際には
多すぎるバッファーは泳動がおそくなりますね。

バッファー濃度は濃い方が抵抗値さがるから電流は増えるでしょ。
水を入れればおそくなり、つけ汁で濃くなれば早くなるのは、
そういうことですよね。

57 :31のバカもの:01/09/11 00:36
ナルホド。
濃度の問題じゃなくて、量の問題でありましたか。
了解しました。たしかにヒタヒタのギリギリだったですよ。
発熱するワケだ。あと、ゲルは流したレーンだけカミソリで切って、
残りは漬けっぱなしの事も多かったから、常に10レーン余りが
泳動槽に入っている状態でした。
乾燥して厚さが元の半分くらいになったゲルにも平気で流してました。
上のを書いてから、自分なりにTAEのAが飛んだら流れ易くなんのかな?
ていうことで、マードーデモイーヤと思ってました。
だって、イオン強度の問題だけなら、上から塩を加えれば早くなるの?って思ったし。
案外ホントに塩をひとつまみで早くなったりして?

それから、トランスフェクション用のDNAですが、ずっとCsClx2回廻してましたが、
最近は1回しか廻しません。リン酸カルシウムで、バラつきはありますが効率はほぼ同じくらいでした。
CsClを入れる前段階に雑味をなるべく加えないようにしたあと、
CsClを入れる直前のペレットにちびっとだけRNaseを加えます。
CsCl超遠心後は、イソアミル→フェノクロ→エタ沈→溶かしてエタ沈。
エタ沈の時、NaOAcよりNaCl(5Mx1/10vol+EtOHだから、25mMくらい)の方が
いいらしいっていう人がいますが、意味有りますか?

58 :名無しゲノムのクローンさん:01/09/11 01:43
RNaseは機雷だ!
1,2,3のステップの後に最終濃度2Mリチウム酢酸を加えて10分氷上で放置、2倍量のエタノールを加えて遠心、
そのあとCsCl遠心に回すも、70%エタで2回洗って制限酵素で切るのも、各人の自由。
500bpより大きなDNAを見るにはこれで十分。

59 :名無しゲノムのクローンさん:01/09/11 01:45
↑、氷上放置後、遠心、上清を新しいチューブに移してエタノールを加えるんだった。

60 :名無しゲノムのクローンさん:01/09/28 21:07
トランスフェクション用でもDNAもCsCl回してません。
丁寧にプレップすればほとんどクローズドです。

61 :名無しゲノムのクローンさん:01/09/29 11:07
>>13さん
漏れはやったことないからわかんないけど、ミューピッドで
buffer薄めるとDNA早く流れるってのが本当だとすると不思議だよね。

これが定電圧でなくて定電流だったら、buffer由来のイオンが減ったせいで
DNA以外のイオンが流れてくれないので、
定電流を保つためにDNAがどんどん流れるって理屈ならわかるけどね。

>>36さん
ジュール熱の式 Q=IVt
からすると、抵抗増えて電流値落ちれば熱は出なくなるんだよね。
(Vは一定だから)こっちの方がreasonable。

62 :名無しゲノムのクローンさん:01/09/29 11:38
>>61
そんなこといってるから生物系は頭悪いっていわれちゃうんだよ。
バッファが濃いと、単にDNAにかかる分電圧が低くなるだけ。
薄すぎても、電流が流れなくなるから駄目だけど。

63 :61:01/09/29 17:57
>>62
そうかな?
電圧は「電場」だから
buffer由来のイオン(Trisなど)にもDNAにも
同じの力が加わる筈だよ。

64 :61:01/09/29 18:10
↑もちろんchargeが同じだとしてね。

QE=6πηru
(Qがcharge、Eが電場、ηは溶媒の粘性定数、rはイオンの仮想半径で、
uが電気泳動易動度)
この両辺がイオンやDNAにかかる力。

むかし島尾先生の講義で聞いた。

65 :62:01/09/29 19:03
回路図かいて見りゃすぐに分かるよ。

(+) -- チャンバのバッファ(R0) -- [DNA(R1) + ゲル中とゲル上のバッファ(R2) ] -- (-)

(-)側のバッファは(+)といっしょにして考えることが出来るから略。
これを使って式を立てる。
また、R2はR0とは距離と断面積を係数とする比例関係にあるから、
それをつかって式を簡略化する。
最終的に、定電圧ならR0とR1の比でDNAの分電圧が決まることになる。
R2の値にはR0と断面積が影響するので、バッファの濃度と量が
DNA分電圧の変動要因になるというわけ。

この程度の内容は中学校で習うんだから、簡単に導いてよ。

66 :61:01/09/29 19:46
なるほどね。
ミューピッドって(+)も(-)もみんなつながっているから
回路図って発想は湧きにくいよね。

bufferを薄めることで、R0とR2は上がるわけだ。
電圧は一定だから相対的に抵抗の少ない分
抵抗R1のDNAは電流値を増やす。
だからDNAは早く流れる。

それでいいのかな?

67 :名無しゲノムのクローンさん:01/10/06 02:42
DNAもトリス-グリシン バッファーで流す。

68 :名無しゲノムのクローンさん:01/10/06 03:53
>>66
ま、そう言うことです。
式立てて、微分してみればどの辺が最大か分かるはずなんだけど
あまり大差ないだろうから面独裁や。

69 :名無しゲノムのクローンさん:01/10/21 01:18
FACSのことなんですけど、
染色時間や細胞数を結構いい加減に設定してもちゃんとデータが
でてしまうことはわかったのですが、ゴミ(死細胞)がときどき
混ざってしまいます。どうしたら減らすことができるでしょうか?

70 :名無しゲノムのクローンさん:01/10/30 18:20
FS-SSでゲートをかけて、いいやつを拾ってきなさい。。。

71 :名無しゲノムのクローンさん:01/10/30 19:04
7-アミノアクチノマイシンDを使えば、生細胞と死細胞を染め分ける事が出来る。
ちなみに死細胞が染まる。

72 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/06 07:49
実験の基本は面積の少ない96穴

73 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/10 10:11
大腸菌のコロニーからラージプレップするとき、まず3ml程度のチューブで
培養してから大きなフラスコに移すのが一般的ですが、どうしていきなり
コロニーからフラスコに菌を入れたらいけないのでしょうか?
うちのラボの連中によると、一旦菌が増えているか確認できるからだとか、
大腸菌が苦しんでリアレンジメントが起こりやすいとか言っていますが
誰も本当のところを知りませんでした。

74 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/10 12:46
大きなフラスコにコロニーから無菌的に植菌するのが難しいから。
漏れは直接やっちゃうけどね。

75 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/10 16:09
それだけの理由なの?知らなかった

76 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/11 03:30
E-coliって増殖にdensityの問題ないの?

77 :名無しゲノムのクローンさん :01/11/11 04:02
>>73>>75
bacteriologyのなごりで。purecultureからOD測っておけば
stational phaze手前までの時間があらかじめ予測できる。

>>76
培養するだけなら問題なしかと。もちろん高密度はまずい。

78 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/11 04:10
>>77
げ、タイプミス。もちろんpreculture

79 :名無しゲノムのクローンさん:01/11/24 06:32
1.5ml tubeより0.2ml tubeの方が単価が高いのでは?

80 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/01 00:18
>>79もれもそうおもう。

81 ::01/12/04 00:06


82 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/04 00:13
長時間同じ培地で培養してると抗生物質がヘタるから。

83 :DQNPD:01/12/06 02:16
>>26,27
最近は制限酵素処理(ミニプレとかね)は
やすっちい96プレートでやります。
ふたはセロハンテープでね。
ラベルとかしなくていいし、便利だよ。
最近はミニプレ用の培養液も、
チューブに移す手間が面倒なので、
1.5mlチューブに適当に培地入れて、
菌植えて、ローテーターで37度で一晩放置。
そこからプラスミド取ってます。
たまに増殖悪い菌がいるけど、楽で良いよ。

84 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/06 06:58
>>83
96プレートは私も使っています。蓋付きのもの。テープなんてしない。
しっかりしたプレートなので洗って使い回し。

1.5mlチューブは普通なのでは?ミニプレップにしか使っていないけど。
6時間培養なので1日で結果が出せます。

85 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/06 13:36
>>83
どうやってローテーターを37度に保つの?
ローテーターごとインキュベターに入れるのか?
それができない場合何かいい方法はない?

86 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/06 13:45
LB培地に硝酸カリウムを10g/liter入れて、37度に静置すればよい。

87 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/06 13:59
>>73
もう話は終わったのかもしれないけど,一応コメント.
培地の酸性化,とか,抗生物質が分解される,とかそういう理由のはず.
培地が酸性化するから,というのは昔よく聞いた.
でも50-100ml程度だったら,私はグリセロールストックから直接培養します.
さらに横着するときはトランスフォーメーションしたプレートに直接LB蒔いて溶かして,培養したりすることもあり.

プラスミドをとる程度なら,培地の酸性化なんてあんまし気にする必要もないと思いますが,どうでしょ?

88 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/06 15:50
>>87
Cmなんかだとへたりはほとんど問題にならないと思う。
やはり培養時間が予測しやすいことが肝だと思う。

>>電気泳動の件

ミューピッドの電源装置がちゃちなのはみなさんご存じの通り。
ということは、電源の内部抵抗が非常に高い。この内部抵抗の影響で、
流す電流値が高いほど、電圧降下を引き起こす。従って、できるだけ
バッファー中を電流が流れない方が泳動電圧が上がる=泳動が速くなる
ということが起きる。そういうことは電源屋では常識だが?

良い電源と安物の違いは、ひとえに電流供給能力の違い=内部抵抗の違い、
といっても過言ではない。

だが、せっかくのバッファー(緩衝)能力が発揮されないと思うから、
実験に再現性が無くなったり、高次構造に騙されたり、足下を掬われる
ことになりかねんから、基本には忠実に。

89 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/06 16:13
ミューピッドの電源はダイオードブリッジ+抵抗分圧による
簡易電源、すなわちヒューズ付きのほとんどAC直結、構成じゃなかったっけ?
この場合の内部抵抗とは???

90 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/06 16:21
100Vで仮に0.2A流れたとすると、500オーム。
内部抵抗なんてその数%以下だろうと思われるから、
電圧降下も10%もない程度じゃないだろうか。
その程度では問題になるとも思えんが・・・

91 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/06 16:38
>>86
なんで硝酸カリウム入れるの?

92 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/06 18:57
>>88
抗生物質が分解される,ってのは,大腸菌に分解されると言う意味です.
耐性遺伝子をもってたら,抗生物質分解するんじゃなかったっけ?

93 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/07 01:09
>>92

Cm耐性は非分泌性なので大丈夫!

94 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/28 14:24
age

95 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/28 14:29
ミューピッドの電源、ワンチップICの定電圧電源がブ
リッジ無しで入ってるんじゃないか?
秋葉原のパーツ屋で200円くらいのチップだ。
だもんで、電圧は一定なもんでバッファーがへたって来ると
過電流が流れやすくて、そうするとチップが壊れる。
それを防ぐために、すぐ切れるヒューズがはいっているんだと
思うけど。それにしてもあのヒューズはよく切れる。

96 :>86:01/12/28 14:31
酸素の変わりにNO3-が電子受容体になって、末端酸化酵素を介して呼吸鎖を動かす。
硝酸入りの静置培地で生育した大腸菌を集菌するとずいぶん赤みのかった色になっている。

97 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/28 14:57
>>95
三端子レギュレータのことを言ってる?
もしそうだとしたら、100V入力じゃ発熱が大変だと思われ。放熱板
つけなきゃならなくなる。
実際は単なるダイオードブリッジ。100Vは全波整流、50Vは半波整流、
コンデンサによる平滑化すら無しの超簡易回路だよ。

98 :名無しゲノムのクローンさん:01/12/28 17:29
>>97
了解した。
確かに100V入力のできるレギュレータなんて、
あのサイズではないな。

99 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/14 02:12
SDSのゲルを脱色液に漬けた後、ビニール手袋してゲルを指で連打。
すぐにバンドが見えてくる。

制限酵素処理後、制限酵素を除いた後にBAPしたいとき、キアゲンのgel extract kitで処理する。んで、最後にカラムから溶出する時はelition bufferじゃなくて、BAP bufferで溶出する。

100 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/14 04:23
もれは制限酵素処理した溶液に直接CIAPをつっこむ。
plasmid 1 ugを50 ulの系で切ったらCIAP 1 ulとか。
その後gel extract。

101 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/14 07:30
>>100
なんで脱リン酸化した後gel extractするの?
>>99
gel extract kitですか、PCR purification kitの方が・・・

102 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/14 07:31
>100 漏れは制限酵素と一緒にCIAP入れちゃう。量は>100と同じくらい。

103 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/14 15:57
CIAPよりBAP

104 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/14 16:01
>>101
PCR purification kitでした。

>>100
制限酵素を除去してライゲーションする為と違いますかね?

105 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/14 18:07
私はSAP派

106 :100:02/01/14 18:34
>>104そうです。

107 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/15 01:25
>>104>>105
そうなんだ。vectorはゲルから回収すると決まってコロニーがでてこないから
絶対にしないことにしている。

ちなみに熱失活させておけば問題ない。失活させなくても(忘れても)上手くいったヨ
でもPCR purification kitを使っていれば制限酵素も除去されている。

108 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/15 02:12
>100
え?切れ残りのvectorがあるとまずいからgel extractすんじゃないの?
>107
> vectorはゲルから回収すると決まってコロニーがでてこないから
ん?俺は大抵できているけど?

109 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/15 02:46
E.Coli用アガロース培地を作る時は専らレンジでチン。
ラージプレップ用LBでもレンジでチン。

泳動用アガロースゲルは、レンジで融かしてBioradのSDS-PAGE用
ガラス板の上に注ぎ込んで、串さして終わり。
デカい方だと25mlまでは表面張力で溢れ出ないよ。
流す時はミューピッドサイズの泳動槽でも150Vで流す。

で、余った時間で2chに行き有意義なディスカッションをする。
( ゚∀゚) <Umahhh

110 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/15 05:34
> E.Coli用アガロース培地を作る時は専らレンジでチン。
> ラージプレップ用LBでもレンジでチン。
よーするに電子レンジだけで滅菌できるってことでしょーか?

111 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/15 05:34
泳動用アガロースゲルはたくさん作っておいて1XTAE中で室温保存。
ただし、ウェルを上に向けておくと析出してきた塩がウェルの中にたまってきてしまうので
必ずウェルは下にする。さらに、保存しておいたゲルを使うときは、サンプルをロードする前に
バッファでピペッティングしてウェルの掃除をしておくことも忘れない。

112 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/15 11:24
最近の鞭毛の有無が電顕を使わずに判別できる
方法をどなたか教えてください。
学生実験で教わった鞭毛染色、全く使えません。
ちくしょぉー、このクソ忙しいときに
電顕壊れやがって!!ヽ(`Д´)ノ ウワァァン

113 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/15 12:42
暗視野顕微鏡で見たら?

114 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/15 13:31
>>111
私はタッパーの底に水で湿らせたティッシュを置いて
その上にゲルを置いて室温保存している。

115 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/15 13:33
113が良いことを言った! しかし112の「最近の」は「細菌の」じゃないのか!?
暗視野でいいのか?

116 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/15 13:42
光学顕微鏡で「細菌」の鞭毛が見えるのか?!

117 :112:02/01/15 13:52
最近→細菌です。
スマソ……逝ってきます

光学顕微鏡で見えますか?
何かで染色してから見るんですか?

118 :113:02/01/15 14:48
>>115
暗視野で大腸菌の鞭毛長さ測ってたねーちゃんが生物物理学会にいた。
>>117
染色はしない。横から光を当てて反射・回折した光だけを観察する。
専用のコンデンサーが必要。
俺も詳しくないから、後は顕微鏡の参考書や生物学辞典でも見てくれ。

119 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/15 20:05
>>110
そそ。フラスコの口をラップでクルクル巻いて筒作って、
レンジで沸騰させる。急いでる時はすぐ水につけて冷やす。
でもこの時ちゃんとしたフラスコ使わんとパリンといくよ。

長期保存にはお薦めしないけど、トランスフォームして次の日の朝
つつくなら十分使える。朝10時頃つつけば夜7時には生えてるから、
ミニプレして夜10時には結果が見える。で、次の日ラージプレップに
持っていける。 ( ゚∀゚) <Umahhh

120 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/15 21:28
>>114
そのまま冷蔵庫で永久保存

121 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/15 22:20
>>87 グリセロールストックから直にラージに移る派です。
けど、low copyのプラスミドとか、鎖長が長いプラスミドを取るときに、
3〜4時間後に抗生剤を追加して、cultureしてるんやけど、上手く取れるときと取れないときの差が
激しくって困っています。何か上手い方法知っている方みえたら教えてください!!!

122 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/19 03:59
>>121
菌を回収する前に氷冷するとプラスミドのコピー数が増えると
きいたことあるけど。
でも、専門家じゃないから実際コントロールとってやったことはないけど。

123 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/19 12:46
>>121
抗生剤って、camだよね。
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/1009340905/l50
こっちで聞いた方がよいかな。

124 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/19 17:30
すてーしょなりふぇーずまで大腸菌を培養した後、
クロラムフェニコールを加えて一晩振って、プラスミドコピー数を増やす操作って
どの系統のプラスミドだと効果がありますか?
菌株やインサート長も影響しますか?

125 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/19 23:18
>>122 今度試してみます。E.coliが早く増えすぎるときはいつもダメみたいなので、cultureするときの温度も関係しているのかも知れません。
>>123 ampのときです。スレ違いすんません。
>>124 pBR322などに効果があるようなことを聞きました。oriが関係しているらしいです。
   キアゲンの説明書にはcolE1(合ってる?)系とあともうひとつの系に有効と書いてありました。
   ためしに今うまくとれてないプラスミドでクロラムフェニコール加えてみたところ、とたんに増殖が抑制されました。
   それは偶然にもプラスミドがよくとれたんですが、どうなんでしょう??

126 :123:02/01/20 00:00
ampでしたか。いや124の操作がうまくいかないのかと思ったので。

127 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/20 00:49
pBRくらいなら5ml以上の菌液使えばいいじゃん。

128 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/20 11:22
>>124 クロラムフェニコ−ル法はプロスミドによって
増幅のオーダーすら変わるからちゃんと濃度ふって
最適値をもとめたほうがいいよ
pBR系でもほとんど増えないやつもいる(経験済)
J.Bacteriologyの古い論文にいろいろのってる

129 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/29 14:21
QiagenのQiaprepSpinを再生して使ってる人いますか?
://www.biowire.com/bw_jsp/single_product_review_top.jsp?fr=10&rid=15444&tid=5&ru=9206
こんなん見かけたのでやってみたんですけど、自家製のアルカリリシスじゃうまくいかないっす・・
soln3の塩濃度が濃すぎるのかな・・

130 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/29 16:16
ヲレはいつも1リットルの2xYTで生やした大腸菌をアルカリーSDS法→CsCl超遠心x2回だ。プラスミドは10mgは盗れる。

文句有るか?

131 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/30 01:11
>>130
そんなにとってどうする。
CsClはたかいんだじょ。

132 :130:02/01/30 13:45
物取りしてるんで、そのDNAを使ってセミコンフルエントHEK293cell約200プレートにリン酸ーカルシウム法トランスフェクションします。

133 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/30 13:50
>>129
QIAGENのminiprepだったら使いまわしまくってるよ。
3〜5ml培養してP1、P2、N3加えて遠心。
カラム通してさっとプラスミド。30分程度。
使ったカラムはミリQで3回ウォッシュ。

そんな感じ。


134 :129:02/01/30 16:46
>>133 とれたりとれなかったり再現性がなさそうに見えたので今捨てちゃいました(w
それはそうとP1、P2、N3足りなくなりません?
それで、Molecular Cloningにのってるでやってみたんですけどだめだった、と。
まぁ、P1、P2はsolution12とほとんど一緒だし、P3は割と多めに入っているので
2回分ぐらいはありそうですけど。solution3の濃度を半分にすればいいのか、
それともP1に入っていないグルコースがなんかやらかしてるのか・・

135 :名無しゲノムのクローンさん:02/01/30 18:41
>>134
あれはイオン交換カラムだから使いまわしはできますよ。
miniはやったことないけどmaxiは
研究費がないころ使いまわしていました。
1回でもカラムを乾かしてしまうとダメだと思いますよ。

136 :129:02/02/01 06:34
129です。なんか、ハッキングモードに入ってちょっといろいろやってみました。
solution1 100μ solution2 200μ solution3 150μ + 新カラム→ X
solution1 100μ solution2 200μ solution3 150μ + H2O 400μ→ X
solution1 250μ solution2 250μ N3 350μ → ○
ただし、solution1にRNaseが入ってないせいか、ゲルで流すと1000bp以下のところに
どどーんと出ます。これってRNAでいいんですかね?
それで、ちょっとpHを測ってみました。solution3 5.3  N3 4.2
どうりでS3とN3の匂いが違うと思った。solution3でうまく行かない理由はこれですかね?
ところで、どなたかPBとPEもどきのレシピご存じないですか?

>>134 でかいやつは多分乾かすとひび割れちゃうからだめなのかも。。miniは乾かしても
大丈夫っぽいです。gel extraction kitはひび割れちゃいましたが。

そういえばlargeの樹脂はQBTで平衡化しますよね。
という事は出荷時は塩基型になってるのかな?miniもS3で洗って酸性型にしてから使えば
DNA引っ掛かってくれるかな。。

137 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/02 07:05
たいした技ではないが、ウェスタンでセミドライブロッターを使って転写するとき、人によるけど、辞書やSigmaのカタログなんかを”重石”としてブロッターの上に乗せる人いるよね?乗せない人もいるみたいですけど。
で、その時、Bio Craftなんかの重めの電源を使う場合、こいつ自体を重石代わりに使ってるんですが、これは、どうですか?
ブロッター複数枚使用時も、全部積み上げて最上段に電源。
机上スペースが電源分だけ多少空いて、少し得した気分です。

138 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/02 09:51
>>138
うちは1リットルくらい水の入ったビンを置いています。
電源装置はちと重すぎるような・・
薄いPAGだと押しつぶされちゃったり、濃いPAGだとひび割れたりしませんか??

139 :138:02/02/02 09:51
138は漏れだった・・・ウツダシノウ。。。

140 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/03 00:11
しがない学部三年のものです。
形質転換でエレクトロポレーション後に菌を培養しますよね?
Ampであれば前培養は入らないというお話がありましたがなぜですか?
あと先日、サイズの大きいプラスミド(アグロ用)を培養後(LB2ml)、
プラスミド抽出をしました。
しかし異様にとれが悪いのですがなぜだかわかりません。
どういった理由が考えられるでしょうか?
ぜひ理由を教えていただきたく、お願いいたします。

141 :133:02/02/03 00:38
>>134

再現性ない?
実験の方になんかまずい点があるのでは?
P1は大量に作っておいたやつをずっと使ってます。
P1、P2、N3は単体で売ってませんでしたっけ?
キアゲンのインストラクションに組成書いてあるから
作れるけど、めんどいよね。

ちなみにmidiは使いまわししてません。
miniはもう何回使ってるかわかんないくらいだけど
普通にプラスミドとれてくるけどな。

まぁラボが貧乏ってわけじゃぁないんですけど
使いまわせるなら使いまわそうと。


142 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/03 00:40
>>140
スレ違い。それともネタか?
アンピシリンとカナマイシンの作用機構の違い、プラスミドのコピー数について勉強しなさい。

143 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/03 04:04
>140
実験の質問はこっち↓でな。
「▼今実験でうまくいかないこと▼パート2▼」
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/1009340905/l50

Ampに関してはここ↓に出ているよ。
「★★実験の手抜き・節約・時間短縮method★★」
http://cheese.2ch.net/test/read.cgi/life/1010893696/
ただし、明らかにここと重複スレだからあげちゃダメ。
つーか該当部分を選んで全部こぴぺしとくわ。34はかなーりお役立ち情報だ。

6 :名無しゲノムのクローンさん :02/01/13 13:07
大腸菌のトランスフォーメーションの時、
アンピシリンで選択する場合は、
前培養(LBで一時間くらいあっためるやつ)は省略する

20 :名無しゲノムのクローンさん :02/01/13 13:35
前培養って、アンピシリン以外の抗生物質でも、
いらないやつある?
カナマイとかハイグロとかは?

24 :名無しゲノムのクローンさん :02/01/13 14:01
>20 転写/翻訳を阻害する抗生物質は前培養しないとだめ。
アンピシリンは細胞壁合成を阻害するので省略可。

34 :名無しゲノムのクローンさん :02/01/13 14:17
>>20
昔、そのテの手抜きに興味があって、いくつかの抗生物質(と、もちろん対応
する耐性遺伝子を載せたなるべくidenticalなplasmid)でタイムコースを
とって確認したことがある。

結論は、6の言うとおり、アンピシリンは、形質転換直後にまいても
一時間液培後にまいても、効率は全く変わらなかった。
一方、カナマイをはじめクロラムフェニコール、テトラサイクリン等は、転換直後
にまいた菌はほぼ全滅。
なにしろ10年近く昔、教官に隠れて趣味でやった実験なんでよく覚えてないのだが、
確かカナマイの場合、転換後15分ぐらいからコロニーがあらわれはじめ、1時間後
にはほぼ安定する。2時間以上液培すると再びコロニーの漸増がみられる。
おそらく液体培地の中で細胞分裂をはじめている影響と思われる。

妙だったのはテトラサイクリンで、どれだけ前培養しても、決して出現コロニー数が
安定することはなかった。だらだらと増えていくのみ。テットの薬剤耐性はかなり
特殊なんで(確か細胞膜のポンプ活性)、耐性が出るまでに時間がかかるのかな、と
思ったことを覚えている。
こんなんで役に立つかね。


144 :143の続き:02/02/03 04:05
39 :1 :02/01/13 14:37
ただし,これを読んでも,初心者にはいきなり教えない方がいい.
昔,後輩に,前培養の意義を教えてから,
アンピシリンのときはしなくて良いよ.
っていって,やらせてたら,
一年後に,そいつかカナマイでやったときにも前培養せず,
しかも前培養の存在すら覚えてなかったりした.
あるていど,基本的なことを覚えさせてから,
おしえましょう.

78 :名無しゲノムのクローンさん :02/01/17 01:03
なんでtransformationのときに抗生物質がアンピシリンだと前培養がいらなくて
カナマイシンだといるのかがわかりません。アンピシリンは細胞壁合成を妨げ、
カナマイシンが転写翻訳を妨げると聞いても????
ヒントだけでもプリーズ!

80 :名無しゲノムのクローンさん :02/01/17 03:23
耐性遺伝子が発現する前に効いたらどうするよ。

81 :N :02/01/17 10:08
>78
静止期と細胞分裂がヒント。どの時点で耐性遺伝子産物が必要か、
考えてみたら分かる。
静止期にも翻訳は必要だろ。それがジャマされたらどーなるよ?
アンピシリン耐性なら、増殖期に入る直前までに獲得されていたら
OK。

145 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/03 05:22
>>142-144
エレクトトロポレーションの場合は必要だと聞いたが。
とにかく早くSOCを入れるのが効率に関わるって習った。
いまじゃ装置が無いから確かめられんが・・・
普通のプラスミドには関係のない方法だね

146 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/03 05:59
>145
ということは、普通のトラフォメの時と、エレポの時では、前培養の意義が違うってこと?
普通のトラフォメの時は、要するに抗生物質に対する耐性を獲得するために必要な時間。
ではエレポの時は?

147 :129:02/02/03 07:21
>>141 再現性はあったようです。プラスミドが入ってないコロニーばっかりつついて
いたことがわかって、またそれを調べるために新品使って入ってないことを証明したり
してしばし落ち込み。カナマイシンにボコボコ生えてんじゃねー>BL21(笑

P3はlargeのカタログに載ってましたけど(アルカリ法のsolution3と同じ)
N3は載ってませんでした。確かに買えますけど、それでは裏技魂が(w
っていうか、PEとかPBはどうされてるんですか?largeのQCとは多分違いますよね……
pH下げた70%エタノールでもいいのかな?pH4.2のS3も作って月曜日にでもトライしてみます。

ちなみに、うちの研究室は金はありませんので、使えるものは使い回すのが大好きです。
で、使い回しが自前でできるとミニプレップ48本とか気兼ねなく出来るのでいいなぁ、と……

148 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/03 13:05
>>129 qiagen miniprep kitはイオン交換と違ってシリカ系だよ(midiとかはイオン交換)。
P3にいっぱいchaotropic saltはいってんのがN3ちゃうの?



149 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/04 03:24
>143,144
ありがとうございます。更正部室はわかりました。
私はアグロのプラスミドはただ単に、
コピー数というよりもoriの違いかと考えていました。
オリの違い=コピー数の違いですか?
完全なるスレ違いでごめんなさい

150 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/04 12:35
>146
普通のトラフォメの前培養は耐性獲得&塩等の希釈。
だから、別に効率無視して生えればよいなら、滅菌水で希釈して播いても可。
で、エレポの前培養は菌体がパルスで穴開けられたダメージの回復では?
流石にそままだと死ぬだろ。



151 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/04 22:20
>150
>で、エレポの前培養は菌体がパルスで穴開けられたダメージの回復では?

プレートでは回復しないが、液体培地では回復するということか???
じゃあ極端な話、抗生物質の入ってないプレートにまいても死ぬのだろうか。

152 :146:02/02/05 00:46
>>151
私がやった時はまだ学生の時でした。しかも普通の形質転換(化学法でいいんだよね?)
でもプレカルチャーはやるのが当然と思っていました。エレクトロの場合は装置の持ち主
のところに行って借りていたんですが、その人の説明が>150さんと同じでした。
今、普通の形質転換でAmpの場合プレカルチャーをしなくなって>151さんと同じ疑問は
あります。
で、持ち主はいろいろ試していたみたいで、パルス後、どれだけ早くSOCを入れるかで
効率がよくなるかが変わってくると言っていました。


153 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/05 11:16
>>151
酵母ではプレーティングの時にガシガシ塗ると、明らかにダメージを受けるようです。
(コロニー数が少なくなる)
エレポ直後のヤワヤワ菌体の状態ではプレーティングのあの摩擦でもダメージになるのでは。
全く生えないとは思わないけど。
パルス後にSOCを入れる早さで効率が変わるというのは私も経験あり。
プレーティングよりもSOCを入れるほうが時間がかからないし、
パルス後に直接プレーティングしても効率悪そうです。
それではエレポの意味がない。

154 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/08 21:52
だれか電子レンジで大腸菌はやすプレート作ってませんか?
過去ログ見たような気もしましたがちょっと見つけられなかったので、、、
いちいちオートクレーブするのは面倒だよう。

155 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/10 03:31
>154
このスレの>>109>>119を見よ。

>>109
>E.Coli用アガロース培地を作る時は専らレンジでチン。
>ラージプレップ用LBでもレンジでチン。
>>119
>フラスコの口をラップでクルクル巻いて筒作って、
>レンジで沸騰させる。急いでる時はすぐ水につけて冷やす。
>でもこの時ちゃんとしたフラスコ使わんとパリンといくよ。
>長期保存にはお薦めしないけど、トランスフォームして次の日の朝
>つつくなら十分使える。

でも、おいらなら、一度に1リットルくらいオートクレーブして普通に作って冷蔵庫に
保存しとくけどね。作りたては水っぽくって使いにくいし。

156 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/15 19:13
age

157 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/15 23:11
ついにネタ切れか、、、

158 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/21 04:07
まだ出てくるだろう???

159 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/21 04:24
part1からここまで、誰かまとめて...
え?言い出しっぺというのがパターンですか?
そういわずに。

160 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/21 18:15
前にもどっかに書いたけど、プラスミド回収の話。

アルカリSDS/イソプロ沈後のプラスミドをファイナル1.5mMになるようにスペルミジンを加えて10分遠心。50%イソプロ w/ 300mM
NaCl、10mM MgCl2でウォッシュ。シーケンスグレードのプラスミドの出来上がり。実際に読めたよ。

PCRプロダクトの精製には1mMスペルミン。'99 Vol. 17 p. 822 Natureバイテクより。

161 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/26 00:22
age

162 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/26 00:28
シーケンス用のサンプルをいちいちRNaseA→PEG沈する必要なし。
Alkali法のSolI、K、L→エタ沈したら、ペレットを100μg/ml RNaseA
入りTEに溶解して、そのままシーケンス。
シーケンスを邪魔してたのは、中途半端な長さに分解されたRNAだった…


163 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/26 01:52
>>162
同志よ。周りではなかなか信用してもらえないけどほんとにこれでうまくいく
から楽になったもんだ。サイクルシーケンスで伸長温度が上がったこともある。

うちはRNaseが薄いけど2時間37℃でたっぷり処理してた。濃くすればいいのか。

164 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/26 19:50
7年ぐらい前その方法でdye primerはやってたけどdye terminatorもうまくいくの?
最近はやり直すのは絶対イヤなのでキット使ってるなあ。

それよりそのグレードのプラスミドでトランスフェクションうまくいくかな?
QIAGENのプラスミド取りキットって説明書どうりの収量がコンスタントにだせなくて
困ってます。とっても高価なのに、、、

165 :147:02/02/27 02:33
いろいろやってみた結果、MSDSにも書いてある(最初から見とけばよかった……)グアニジンHClを
10%ぐらい入れたpH4.2の溶液をN3の代わりに使うことでカラムに引っ掛かるようになりました。
MSDSには25ー50%って書いてあるんですが、20%も入れると再結晶しちゃうんですけど。。 ま、いっか
あと、KOAcの濃度も低めにしないと沈殿します(多分KCl) だからN3もアルカリ法Soln3に比べてpH低めのものを
多めに入れているのではないかと思いました。
ちなみに、Qiagenに質問したところ良くある質問らしくて(ならFAQに書いといてくれ(w)濃度は明らかに
できないがグアニジンSCNが入ってるそうです。確かにそっちの方がカオトロピックっぽいけど、ほんとですか〜?
で、PBの代わりに代用N3で、PEの代わりに70%エタノールで洗って溶出してます。

あと、これはオカルトかもしれないんですが、P1、P2、N3をマニュアル通りじゃなくてアルカリ法分量
(100、200、150μL)で入れたほうが沈殿がかっちりします。low copyのやつを6ml 2xYTカルチャーから
とろうとするとよくゲル状になってたんですが、これできっちり遠心できるようになりました。

ところで、アルカリ法Soln1のグルコースってなんで入ってるんですか?

166 :名無しゲノムのクローンさん:02/02/27 22:43
Molecular Cloningの新しい版だとグルコース入ってないよ。

167 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/01 19:26
BACクローンをセシウムを使わないで、簡単に大腸菌から回収する方法ってありますか?
個体へのインジェクションに使えるグレードで。


168 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/16 00:05
あげちゃう

169 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/17 20:23
http://www.toyobo.co.jp/seihin/xr/olul/upld39/rakuchin/pcr.html

PCR単一バンドの出し方。
これって目には見えてないけど、ゲルが
2回目の反応チューブに入って反応阻害の
恐れないのですか?

170 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/20 17:33
>>169
逆にPCRアーティファクトが増えそうな気がする。
nestedならいいかもしれんが、、、。

171 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/20 19:30
>>169
値段の高いアガロースなら大丈夫だろう。
泳動前にバッファーを新しいものに変えておく事を忘れずに。

172 :165:02/03/21 02:56
>>166 もう4版が出たの?はやいなぁ・・ ちなみに、3版はA1.16
グルコースの謎に関しては質問すれに行ってきます。
P1、P2、変性N3全部なくなったので現在作成中 
まぁ、RNaseAも買ったのでQiagenも許してくれるでしょう。
ちなみに、4度で保存したときに沈殿が出なかった変性N3でやったら
うまく行きませんでした。(w グアニジンHClは15%以上必要なようです。

173 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/21 15:03
グルコースはリゾチーム処理のために入れていた名残りじゃないの?

174 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/21 22:34
Sol 2を入れたときにpHが極端に高くならないようにバッファーとして
グルコースが入ってるそうな。Current Protocol in Molecular Biology
参照のこと。

175 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/22 02:39
>174
グルコースに緩衝能ってあったっけ?
浸透圧調整とばっかり思ってましたが。

176 :173:02/03/22 05:40
確かにメーリングリストか何かのログにも同じことが書かれていました。
知らなかった。そういえばSol2は本来は用時調整だし、pHは重要なのか。

177 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/23 07:47
だからアルカリ法っていう名前がついたんじゃないの?

178 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/23 08:58
ミニプレップのカルチャーをふたをせずにやるのは常識?

179 :名無しゲノムのクローンさん:02/03/23 09:12
基本。

180 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/16 01:25
>>169
そんなの基本

181 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/16 01:33
>>169
http://natto.2ch.net/test/read.cgi/life/1010893696/l50
こっちの74

こっちの方がレベル高いな

182 :dada:02/04/21 03:09
GILSON ピペットマンの補正の仕方教えてくり

183 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/21 05:49
修理に出す。

184 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/21 12:10
シリンダーにシリコングリスでもぬっとけ。

185 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/21 12:29
補正じゃなくて較正

186 :名無しゲノムのクローンさん:02/04/21 13:08
>>Gilson
講習を受けていない人にはチップコーンやOリング等、
売ってはいけない事になっているそうな、と言ってみるテスト。

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